Publicação

Characterizing the role of the circadian molecular clock in T-ALL

Detalhes bibliográficos
Resumo:	só promovam uma melhor eliminação deste tipo de leucemia como reduzam os efeitos adversos associados ao tratamento. A via de sinalização PI3K está associada ao desenvolvimento de leucemia e, anteriormente, o nosso laboratório descreveu um mecanismo não genético que leva à sua ativação constitutiva com consequente impacto na viabilidade e proliferação das células leucémicas. Este mecanismo envolve a fosforilação inibitória de PTEN, o principal antagonista desta via de sinalização, levada a cabo pela CK2 que, como descrito anteriormente, tem um papel fundamental na regulação do RMC. Outros elementos da via PI3K/Akt/mTOR foram implicados na manutenção das oscilações promovidas pelo RMC. No entanto, o conhecimento relativo à interação da via PI3K com a maquinaria de controlo circadiano e o papel do RMC no desenvolvimento de LLA-T mantem-se limitado. Deste modo, o trabalho elaborado nesta dissertação visou caracterizar a interação entre o RMC e a via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR e usar o conhecimento obtido no sentido de desenvolver terapias dirigidas cuja administração tenha em conta as oscilações circadianas (cronoterapia). Esta estratégia deverá não só incrementar a eliminação das células de LLA-T como diminuir os efeitos secundários associados. Adicionalmente, pretendeu-se ainda descrever o impacto da inativação de Bmal1 da linhagem linfóide tanto na hematopoiese como no desenvolvimento de LLA-T ao analisar um modelo de ratinho gerado no laboratório. Vários autores descreveram que, apesar de diminuídas, as células cancerígenas continuam a apresentar oscilações circadianas. Para confirmar que este é o caso em células de LLA-T, linhas celulares foram transduzidas com um plasmídeo viral que contem um repórter circadiano. Deste modo, fomos capazes de demonstrar que as células leucémicas exibem oscilações circadianas robustas e mantidas ao longo do tempo. Tendo caracterizado as oscilações basais, procurámos determinar se elementos da via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR podem ser responsáveis pela manutenção das mesmas. Para isto, averiguámos o impacto da inibição farmacológica de elementos desta via nas oscilações previamente descritas. O bloqueio individual de CK2, PI3K ou mTOR com inibidores específicos levou a uma diminuição da ritmicidade das células leucémicas, caracterizada pelo aumento do período das oscilações e concomitante diminuição da sua amplitude. Estes resultados não só demonstram uma interação entre os elementos da via de sinalização inibidos e o RMC como a importância da mesma para oscilações circadianas funcionais. Seguidamente, procurámos estabelecer se os elementos da via PI3K/Akt/mTOR oscilam ritmicamente. Para este efeito, levou-se a cabo a recolha de células leucémicas em intervalos de 4 horas durante um período de 24 horas e posterior análise da ativação da via, através de western-blot. Foi possível detetar oscilações circadianas nas principais proteínas desta via de sinalização. Uma vez que a via PI3K/Akt/mTOR apresenta oscilações circadianas nas células de LLA-T e tendo por base o perfil das mesmas, foram desenvolvidos protocolos cronoterapêuticos para administração de um inibidor de PI3K (BKM-120) nos pontos de menor e maior ativação da via. A administração de BKM-120 de acordo com os níveis de ativação da via PI3K/Akt/mTOR leva a um impacto diferencial tanto na viabilidade como na proliferação das duas linhas celulares testadas. De facto, um dos esquemas de cronoterapia implementados aparenta ter maior sucesso na eliminação das células de LLA-T em detrimento dos restantes dois testados. Tendo em conta os resultados, coloca-se a possibilidade do estado da fosforilação de Akt na serina 473 (Ser473) estar subjacente ao sucesso da terapia com BKM-120. Concretamente, estados de menor fosforilação de Akt na Ser473 correspondem à melhor altura para inibir PI3K. Em contraste, tratar as células no pico de fosforilação da Ser473 de Akt leva a uma menor eficácia na eliminação das células leucémicas. Estas observações requerem, no entanto, confirmação. Para este efeito, caracterizámos o impacto da modulação do RMC com recurso a agonistas de REV-ERB nas oscilações da via PI3K/Akt/mTOR. Tendo em conta as alterações promovidas por estes agonistas pretendemos, no futuro, combinar a sua utilização e a cronoterapia com BKM-120 de forma a confirmar a importância da fosforilação de Akt na Ser473 ou de outros elementos para o sucesso da terapia com base nas oscilações circadianas destas proteínas. De forma a descrever o papel do RMC no desenvolvimento LLA-T, foi gerado um modelo de ratinho com Bmal1 especificamente inativado na linhagem linfoide. Após sacrificar estes ratinhos, as células da medula foram recolhidas e transduzidas com a porção intracelular de NOTCH1 (ICN1, um oncogene em LLA-T). Posteriormente, estas células foram injetadas nos hospedeiros e o desenvolvimento de doença foi comparado entre leucemias com e sem expressão de Bmal1. Resultados preliminares sugerem que abolir o RMC tende não só a acelerar o desenvolvimento da doença como originar um fenótipo mais agressivo. Apesar de necessitarem de confirmação, estes resultados refletem o papel de RMC no desenvolvimento de LLA-T, que pode ter consequências ao nível do tratamento. Sumariamente, o trabalho apresentado nesta dissertação permitiu concluir que existe uma interação entre o RMC e a via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR em LLA-T e iniciar a sua caracterização. Por sua vez, esta caracterização permitiu testar de forma informada diversos esquemas de cronoterapia que revelaram a importância da adequação do tratamento às oscilações circadianas para uma melhor eliminação da LLA-T. Adicionalmente, inativar Bmal1 leva a uma antecipação da doença, sugerindo que Bmal1 tem um papel de supressor tumoral em LLA-T e ilustrando a importância potencial do RMC no desenvolvimento da LLA-T. À luz destes resultados podemos concluir que o ritmo circadiano interseta a biologia da LLA-T. Atendendo à natureza pleiotrópica do ritmo circadiano esta interação pode ser importante não só na LLA-T como noutras doenças hematológicas e também em tumores sólidos, emergindo assim como uma nova perspetiva no tratamento do cancro.
Autores principais:	Amaral, Patrícia Alexandra Martins
Assunto:	T-cell acute lymphoblastic leukemia Circadian molecular clock CK2/PI3K/Akt/mTOR pathway Chronotherapy BMAL1 Teses de mestrado - 2023
Ano:	2023
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso restrito
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	só promovam uma melhor eliminação deste tipo de leucemia como reduzam os efeitos adversos associados ao tratamento. A via de sinalização PI3K está associada ao desenvolvimento de leucemia e, anteriormente, o nosso laboratório descreveu um mecanismo não genético que leva à sua ativação constitutiva com consequente impacto na viabilidade e proliferação das células leucémicas. Este mecanismo envolve a fosforilação inibitória de PTEN, o principal antagonista desta via de sinalização, levada a cabo pela CK2 que, como descrito anteriormente, tem um papel fundamental na regulação do RMC. Outros elementos da via PI3K/Akt/mTOR foram implicados na manutenção das oscilações promovidas pelo RMC. No entanto, o conhecimento relativo à interação da via PI3K com a maquinaria de controlo circadiano e o papel do RMC no desenvolvimento de LLA-T mantem-se limitado. Deste modo, o trabalho elaborado nesta dissertação visou caracterizar a interação entre o RMC e a via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR e usar o conhecimento obtido no sentido de desenvolver terapias dirigidas cuja administração tenha em conta as oscilações circadianas (cronoterapia). Esta estratégia deverá não só incrementar a eliminação das células de LLA-T como diminuir os efeitos secundários associados. Adicionalmente, pretendeu-se ainda descrever o impacto da inativação de Bmal1 da linhagem linfóide tanto na hematopoiese como no desenvolvimento de LLA-T ao analisar um modelo de ratinho gerado no laboratório. Vários autores descreveram que, apesar de diminuídas, as células cancerígenas continuam a apresentar oscilações circadianas. Para confirmar que este é o caso em células de LLA-T, linhas celulares foram transduzidas com um plasmídeo viral que contem um repórter circadiano. Deste modo, fomos capazes de demonstrar que as células leucémicas exibem oscilações circadianas robustas e mantidas ao longo do tempo. Tendo caracterizado as oscilações basais, procurámos determinar se elementos da via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR podem ser responsáveis pela manutenção das mesmas. Para isto, averiguámos o impacto da inibição farmacológica de elementos desta via nas oscilações previamente descritas. O bloqueio individual de CK2, PI3K ou mTOR com inibidores específicos levou a uma diminuição da ritmicidade das células leucémicas, caracterizada pelo aumento do período das oscilações e concomitante diminuição da sua amplitude. Estes resultados não só demonstram uma interação entre os elementos da via de sinalização inibidos e o RMC como a importância da mesma para oscilações circadianas funcionais. Seguidamente, procurámos estabelecer se os elementos da via PI3K/Akt/mTOR oscilam ritmicamente. Para este efeito, levou-se a cabo a recolha de células leucémicas em intervalos de 4 horas durante um período de 24 horas e posterior análise da ativação da via, através de western-blot. Foi possível detetar oscilações circadianas nas principais proteínas desta via de sinalização. Uma vez que a via PI3K/Akt/mTOR apresenta oscilações circadianas nas células de LLA-T e tendo por base o perfil das mesmas, foram desenvolvidos protocolos cronoterapêuticos para administração de um inibidor de PI3K (BKM-120) nos pontos de menor e maior ativação da via. A administração de BKM-120 de acordo com os níveis de ativação da via PI3K/Akt/mTOR leva a um impacto diferencial tanto na viabilidade como na proliferação das duas linhas celulares testadas. De facto, um dos esquemas de cronoterapia implementados aparenta ter maior sucesso na eliminação das células de LLA-T em detrimento dos restantes dois testados. Tendo em conta os resultados, coloca-se a possibilidade do estado da fosforilação de Akt na serina 473 (Ser473) estar subjacente ao sucesso da terapia com BKM-120. Concretamente, estados de menor fosforilação de Akt na Ser473 correspondem à melhor altura para inibir PI3K. Em contraste, tratar as células no pico de fosforilação da Ser473 de Akt leva a uma menor eficácia na eliminação das células leucémicas. Estas observações requerem, no entanto, confirmação. Para este efeito, caracterizámos o impacto da modulação do RMC com recurso a agonistas de REV-ERB nas oscilações da via PI3K/Akt/mTOR. Tendo em conta as alterações promovidas por estes agonistas pretendemos, no futuro, combinar a sua utilização e a cronoterapia com BKM-120 de forma a confirmar a importância da fosforilação de Akt na Ser473 ou de outros elementos para o sucesso da terapia com base nas oscilações circadianas destas proteínas. De forma a descrever o papel do RMC no desenvolvimento LLA-T, foi gerado um modelo de ratinho com Bmal1 especificamente inativado na linhagem linfoide. Após sacrificar estes ratinhos, as células da medula foram recolhidas e transduzidas com a porção intracelular de NOTCH1 (ICN1, um oncogene em LLA-T). Posteriormente, estas células foram injetadas nos hospedeiros e o desenvolvimento de doença foi comparado entre leucemias com e sem expressão de Bmal1. Resultados preliminares sugerem que abolir o RMC tende não só a acelerar o desenvolvimento da doença como originar um fenótipo mais agressivo. Apesar de necessitarem de confirmação, estes resultados refletem o papel de RMC no desenvolvimento de LLA-T, que pode ter consequências ao nível do tratamento. Sumariamente, o trabalho apresentado nesta dissertação permitiu concluir que existe uma interação entre o RMC e a via de sinalização CK2/PI3K/Akt/mTOR em LLA-T e iniciar a sua caracterização. Por sua vez, esta caracterização permitiu testar de forma informada diversos esquemas de cronoterapia que revelaram a importância da adequação do tratamento às oscilações circadianas para uma melhor eliminação da LLA-T. Adicionalmente, inativar Bmal1 leva a uma antecipação da doença, sugerindo que Bmal1 tem um papel de supressor tumoral em LLA-T e ilustrando a importância potencial do RMC no desenvolvimento da LLA-T. À luz destes resultados podemos concluir que o ritmo circadiano interseta a biologia da LLA-T. Atendendo à natureza pleiotrópica do ritmo circadiano esta interação pode ser importante não só na LLA-T como noutras doenças hematológicas e também em tumores sólidos, emergindo assim como uma nova perspetiva no tratamento do cancro.

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