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Intracerebroventricular injection of amyloid β1-42 peptide in rat behaviour and adult hippocampal neurogenesis

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A forma esporádica da doença de Alzheimer (DA) é atualmente a causa mais comum de demência a nível mundial, estando particularmente associada ao envelhecimento da população. Esta caracteriza-se por um declínio cognitivo progressivo, acompanhado por atrofia cerebral generalizada. Uma vez que o hipocampo é uma das primeiras estruturas a ser afetadas, notáveis défices de memória podem ser observados nas fases iniciais da doença, nomeadamente na memória episódica de longo prazo, agravando-se progressivamente até uma completa dependência dos respetivos cuidadores. Estas alterações estão normalmente associadas a uma acumulação gradual excessiva de depósitos de péptido β amiloide (Aβ) no cérebro dos doentes, bem como à deposição de proteína tau hiperfosforilada. Mais recentemente, a acumulação de oligómeros solúveis de Aβ em fases pré-clínicas da doença algumas décadas antes das primeiras manifestações sintomáticas, tem sido apontada como fator iniciador da cascata de eventos subjacente à patofisiologia da DA. Apesar da sua crescente incidência, as alternativas para o tratamento da DA são ainda bastante limitadas, e apenas permitem minimizar alguns dos sintomas a curto prazo. Desta forma, uma melhor compreensão dos mecanismos patofisiológicos será essencial para explorar terapêuticas inovadoras e mais eficientes. A neurogénese pós-natal na zona subgranular (ZSG) do giro dentado (GD) do hipocampo ocorre através de um processo sequencial relativamente conservado entre mamíferos, no qual novos neurónios funcionais são originados a partir de células estaminais/progenitoras neurais (CSPNs) indiferenciadas e com capacidade de autorrenovação. Este processo parece contribuir significativamente para funções dependentes do hipocampo, como plasticidade sináptica e funções cognitivas, particularmente aprendizagem e memória, pelo que tem sido sugerido como um potencial alvo terapêutico da DA. No entanto, estudos in vivo e in vitro, referentes à forma como a neurogénese poderá ser modulada nesta patologia apresentam resultados altamente controversos, provenientes na sua maioria do uso de modelos da forma familiar da doença. Assim, a maioria dos estudos indica uma diminuição da proliferação e diferenciação, embora um aumento também seja mencionado por alguns autores e, mais raramente, ausência de alterações. Desta forma, o principal objetivo do presente projeto consistiu em caracterizar a neurogénese pós-natal no hipocampo, utilizando um modelo animal que pretende mimetizar as fases iniciais da forma esporádica da DA. Para o estudo da proliferação e diferenciação celular, ratos Wistar jovens-adultos (9-10 semanas) foram injetados intraperitonealmente com 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) (100 mg/kg) durante 3 dias consecutivos, no início do protocolo. Seguidamente, com o objetivo de obter o modelo de doença proposto, realizaram-se cirurgias para a injeção intracerebroventricular (icv) unilateral de uma solução de péptido Aβ1-42 (2.25 mg/ml, 4 μl), ou de uma solução veículo (4 μl), no caso dos animais controlo. Duas semanas após esta injeção, foram efetuados testes comportamentais, durante a fase noturna e diurna do ciclo circadiano, incluindo o teste do campo aberto (do inglês, open-field), para avaliação da atividade locomotora, e o teste de reconhecimento do novo objeto (novel object recognition), para avaliação da memória episódica de longo prazo. Outros paradigmas foram avaliados apenas durante o dia, nomeadamente comportamento do tipo ansioso, pelo labirinto elevado em cruz (elevated plus maze), memória de curto prazo, pelo labirinto em Y (Y-maze) de alternância espontânea ou alternância forçada, e aprendizagem e memória espaciais, pelo labirinto de Morris (Morris water maze). No final do protocolo, os animais foram sacrificados para uma posterior análise celular e molecular, maioritariamente focada no GD. Adicionalmente, o efeito de uma solução de Aβ (20 μM) preparada a partir da solução utilizada in vivo foi também examinado em culturas primárias de neurónios corticais. De acordo com o antecipado, a administração de Aβ1-42 não originou alterações significativas da atividade locomotora, no período noturno ou diurno, nem alterações no comportamento do tipo ansioso, paradigmas que poderiam influenciar o desempenho cognitivo dos animais. Contrariamente à literatura, não foram observados défices de memória a curto prazo, embora no caso do Y-Maze de alternância forçada, o desempenho dos ratos controlo parecesse estar comprometido. Relativamente à memória episódica de longo prazo, quando o teste foi realizado durante a noite, os resultados foram semelhantes aos observados no teste Y-Maze, isto é, não foram identificados défices nos ratos injetados com Aβ mas sim nos controlos, sugerindo um possível efeito deletério da solução veículo. Por outro lado, quando o teste foi realizado durante o dia, ambos os grupos apresentaram um comprometimento no desempenho da memória, possivelmente associado a uma menor atividade exploratória, no caso do grupo com Aβ. No que respeita à aprendizagem e memória espaciais, funções mais especificamente dependentes do hipocampo, não foram detetadas quaisquer alterações. A nível molecular, não foi observada qualquer tendência para variações nos níveis de Aβ1-42 na sua forma solúvel no GD de ratos sacrificados 3 ou 14 dias após as cirurgias, analisado por ELISA. Não foi também detetada a presença de depósitos de amiloide no cérebro destes animais, após marcação histológica com vermelho do Congo. Tem sido demonstrado que a sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) está comprometida nos neurónios na presença de Aβ, devido à clivagem dos seus recetores tirosina cinase B full-length (TrkB-FL), através de um processo dependente da ativação de calpaínas. Assim, os níveis destes recetores bem como do respetivo domínio intracelular (TrkB-ICD) originado pela clivagem, foram utilizados como medida indireta da presença de Aβ. Os resultados obtidos por western-blot indicaram a ausência deste mecanismo de neurotoxicidade induzida por Aβ. De facto, não parece haver qualquer tendência para alterações nos níveis de TrkB-FL ou TrkB-ICD no GD, mas também na zona sub-ventricular, analisada por ser uma região mais próxima do local de injeção, 3 ou 14 dias após a mesma. No entanto, o péptido em solução pareceu estar funcionalmente ativo, na medida em que resultados preliminares das experiências realizadas in vitro revelaram uma tendência para a clivagem dos recetores TrkB, ou seja, uma diminuição nos níveis de TrkB-FL, acompanhados por um aumento de TrkB-ICD e pela ativação de calpaínas. Os marcadores de neurogénese foram analisados no final do protocolo, aproximadamente 30 dias após a primeira injeção de BrdU, com foco apenas na porção dorsal do hipocampo, uma vez que esta parece estar mais intimamente relacionada com funções cognitivas, como memória espacial e discriminação de padrões. Os resultados obtidos nas duas amostras analisadas (AβI e II), embora preliminares, são discrepantes. Ainda que na amostra AβI não tenha sido observada uma alteração no volume do GD dorsal, na amostra AβII observou-se uma tendência para a sua diminuição, consistente com o observado em modelos animais transgénicos e doentes com DA, mesmo em fases pré-clínicas ou iniciais. Relativamente à proliferação celular (BrdU+) e à diferenciação em neurónios maturos (BrdU+NeuN+), não parece haver uma tendência para alterações em qualquer uma das amostras. Em AβI, observou-se uma tendência para um aumento da proliferação de neuroblastos e diferenciação em neurónios imaturos (BrdU+DCX+), embora sem diferenças no número total de neuroblastos/neurónios imaturos (DCX+). Contrariamente, em AβII, ainda que não parecesse haver uma alteração na proliferação de neuroblastos e diferenciação em neurónios imaturos (BrdU+DCX+), o número total de neuroblastos/neurónios imaturos (DCX+) tendeu a diminuir. Estes resultados divergem maioritariamente daquilo que tem sido reportado em alguns modelos esporádicos da doença, os quais apontam para uma diminuição da proliferação e diferenciação, apesar de, até à data, a neurogénese não ter sido avaliada especificamente no modelo utilizado no presente trabalho. Não obstante a injeção icv de péptido Aβ1-42 tenha sido previamente descrita como uma forma de obter um modelo da forma esporádica da DA, nas condições do nosso trabalho não foi possível observar o fenótipo esperado. No futuro, para que seja possível extrapolar acerca do potencial papel da neurogénese na cognição dependente do hipocampo, torna-se necessário aumentar o tamanho da amostra ao nível da análise molecular e celular, assim como proceder à otimização metodológica do protocolo utilizado.
Autores principais:	Paulo, Sara Raquel Landeira Nabais do, 1993-
Assunto:	Doença de Alzheimer Péptido beta amiloide Neurogénese pós-natal Hipocampo Memória Teses de mestrado - 2018
Ano:	2018
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade de Lisboa
Idioma:	inglês
Origem:	Repositório da Universidade de Lisboa

Descrição
Resumo:	A forma esporádica da doença de Alzheimer (DA) é atualmente a causa mais comum de demência a nível mundial, estando particularmente associada ao envelhecimento da população. Esta caracteriza-se por um declínio cognitivo progressivo, acompanhado por atrofia cerebral generalizada. Uma vez que o hipocampo é uma das primeiras estruturas a ser afetadas, notáveis défices de memória podem ser observados nas fases iniciais da doença, nomeadamente na memória episódica de longo prazo, agravando-se progressivamente até uma completa dependência dos respetivos cuidadores. Estas alterações estão normalmente associadas a uma acumulação gradual excessiva de depósitos de péptido β amiloide (Aβ) no cérebro dos doentes, bem como à deposição de proteína tau hiperfosforilada. Mais recentemente, a acumulação de oligómeros solúveis de Aβ em fases pré-clínicas da doença algumas décadas antes das primeiras manifestações sintomáticas, tem sido apontada como fator iniciador da cascata de eventos subjacente à patofisiologia da DA. Apesar da sua crescente incidência, as alternativas para o tratamento da DA são ainda bastante limitadas, e apenas permitem minimizar alguns dos sintomas a curto prazo. Desta forma, uma melhor compreensão dos mecanismos patofisiológicos será essencial para explorar terapêuticas inovadoras e mais eficientes. A neurogénese pós-natal na zona subgranular (ZSG) do giro dentado (GD) do hipocampo ocorre através de um processo sequencial relativamente conservado entre mamíferos, no qual novos neurónios funcionais são originados a partir de células estaminais/progenitoras neurais (CSPNs) indiferenciadas e com capacidade de autorrenovação. Este processo parece contribuir significativamente para funções dependentes do hipocampo, como plasticidade sináptica e funções cognitivas, particularmente aprendizagem e memória, pelo que tem sido sugerido como um potencial alvo terapêutico da DA. No entanto, estudos in vivo e in vitro, referentes à forma como a neurogénese poderá ser modulada nesta patologia apresentam resultados altamente controversos, provenientes na sua maioria do uso de modelos da forma familiar da doença. Assim, a maioria dos estudos indica uma diminuição da proliferação e diferenciação, embora um aumento também seja mencionado por alguns autores e, mais raramente, ausência de alterações. Desta forma, o principal objetivo do presente projeto consistiu em caracterizar a neurogénese pós-natal no hipocampo, utilizando um modelo animal que pretende mimetizar as fases iniciais da forma esporádica da DA. Para o estudo da proliferação e diferenciação celular, ratos Wistar jovens-adultos (9-10 semanas) foram injetados intraperitonealmente com 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) (100 mg/kg) durante 3 dias consecutivos, no início do protocolo. Seguidamente, com o objetivo de obter o modelo de doença proposto, realizaram-se cirurgias para a injeção intracerebroventricular (icv) unilateral de uma solução de péptido Aβ1-42 (2.25 mg/ml, 4 μl), ou de uma solução veículo (4 μl), no caso dos animais controlo. Duas semanas após esta injeção, foram efetuados testes comportamentais, durante a fase noturna e diurna do ciclo circadiano, incluindo o teste do campo aberto (do inglês, open-field), para avaliação da atividade locomotora, e o teste de reconhecimento do novo objeto (novel object recognition), para avaliação da memória episódica de longo prazo. Outros paradigmas foram avaliados apenas durante o dia, nomeadamente comportamento do tipo ansioso, pelo labirinto elevado em cruz (elevated plus maze), memória de curto prazo, pelo labirinto em Y (Y-maze) de alternância espontânea ou alternância forçada, e aprendizagem e memória espaciais, pelo labirinto de Morris (Morris water maze). No final do protocolo, os animais foram sacrificados para uma posterior análise celular e molecular, maioritariamente focada no GD. Adicionalmente, o efeito de uma solução de Aβ (20 μM) preparada a partir da solução utilizada in vivo foi também examinado em culturas primárias de neurónios corticais. De acordo com o antecipado, a administração de Aβ1-42 não originou alterações significativas da atividade locomotora, no período noturno ou diurno, nem alterações no comportamento do tipo ansioso, paradigmas que poderiam influenciar o desempenho cognitivo dos animais. Contrariamente à literatura, não foram observados défices de memória a curto prazo, embora no caso do Y-Maze de alternância forçada, o desempenho dos ratos controlo parecesse estar comprometido. Relativamente à memória episódica de longo prazo, quando o teste foi realizado durante a noite, os resultados foram semelhantes aos observados no teste Y-Maze, isto é, não foram identificados défices nos ratos injetados com Aβ mas sim nos controlos, sugerindo um possível efeito deletério da solução veículo. Por outro lado, quando o teste foi realizado durante o dia, ambos os grupos apresentaram um comprometimento no desempenho da memória, possivelmente associado a uma menor atividade exploratória, no caso do grupo com Aβ. No que respeita à aprendizagem e memória espaciais, funções mais especificamente dependentes do hipocampo, não foram detetadas quaisquer alterações. A nível molecular, não foi observada qualquer tendência para variações nos níveis de Aβ1-42 na sua forma solúvel no GD de ratos sacrificados 3 ou 14 dias após as cirurgias, analisado por ELISA. Não foi também detetada a presença de depósitos de amiloide no cérebro destes animais, após marcação histológica com vermelho do Congo. Tem sido demonstrado que a sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) está comprometida nos neurónios na presença de Aβ, devido à clivagem dos seus recetores tirosina cinase B full-length (TrkB-FL), através de um processo dependente da ativação de calpaínas. Assim, os níveis destes recetores bem como do respetivo domínio intracelular (TrkB-ICD) originado pela clivagem, foram utilizados como medida indireta da presença de Aβ. Os resultados obtidos por western-blot indicaram a ausência deste mecanismo de neurotoxicidade induzida por Aβ. De facto, não parece haver qualquer tendência para alterações nos níveis de TrkB-FL ou TrkB-ICD no GD, mas também na zona sub-ventricular, analisada por ser uma região mais próxima do local de injeção, 3 ou 14 dias após a mesma. No entanto, o péptido em solução pareceu estar funcionalmente ativo, na medida em que resultados preliminares das experiências realizadas in vitro revelaram uma tendência para a clivagem dos recetores TrkB, ou seja, uma diminuição nos níveis de TrkB-FL, acompanhados por um aumento de TrkB-ICD e pela ativação de calpaínas. Os marcadores de neurogénese foram analisados no final do protocolo, aproximadamente 30 dias após a primeira injeção de BrdU, com foco apenas na porção dorsal do hipocampo, uma vez que esta parece estar mais intimamente relacionada com funções cognitivas, como memória espacial e discriminação de padrões. Os resultados obtidos nas duas amostras analisadas (AβI e II), embora preliminares, são discrepantes. Ainda que na amostra AβI não tenha sido observada uma alteração no volume do GD dorsal, na amostra AβII observou-se uma tendência para a sua diminuição, consistente com o observado em modelos animais transgénicos e doentes com DA, mesmo em fases pré-clínicas ou iniciais. Relativamente à proliferação celular (BrdU+) e à diferenciação em neurónios maturos (BrdU+NeuN+), não parece haver uma tendência para alterações em qualquer uma das amostras. Em AβI, observou-se uma tendência para um aumento da proliferação de neuroblastos e diferenciação em neurónios imaturos (BrdU+DCX+), embora sem diferenças no número total de neuroblastos/neurónios imaturos (DCX+). Contrariamente, em AβII, ainda que não parecesse haver uma alteração na proliferação de neuroblastos e diferenciação em neurónios imaturos (BrdU+DCX+), o número total de neuroblastos/neurónios imaturos (DCX+) tendeu a diminuir. Estes resultados divergem maioritariamente daquilo que tem sido reportado em alguns modelos esporádicos da doença, os quais apontam para uma diminuição da proliferação e diferenciação, apesar de, até à data, a neurogénese não ter sido avaliada especificamente no modelo utilizado no presente trabalho. Não obstante a injeção icv de péptido Aβ1-42 tenha sido previamente descrita como uma forma de obter um modelo da forma esporádica da DA, nas condições do nosso trabalho não foi possível observar o fenótipo esperado. No futuro, para que seja possível extrapolar acerca do potencial papel da neurogénese na cognição dependente do hipocampo, torna-se necessário aumentar o tamanho da amostra ao nível da análise molecular e celular, assim como proceder à otimização metodológica do protocolo utilizado.

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