Publicação

Recombinant pre-miRNA-29b: Extracellular production and purification

Detalhes bibliográficos
Resumo:	A terapia baseada em RNA tem avançado rapidamente, trazendo desenvolvimentos promissores para o tratamento de diversas doenças. Os RNAs podem ser divididos em codificantes e não codificantes (ncRNAs), sendo que os não codificantes têm vindo a ganhar grande interesse visto que possuem a função de regulação da expressão génica. Os microRNAs (miRNAs ou miRs) são um exemplo de ncRNAs, que regulam a expressão génica a nível pós-transcricional e controlam processos biológicos com precisão notável, ligando-se de forma complementar aos mRNAs alvo, modulando assim a expressão génica. O pre-miRNA-29b é um desses miRNAs e já é reconhecido por estar envolvido nos mecanismos patológicos associados à doença de Alzheimer. Neste caso, os baixos níveis de miRNA-29b em doentes de Alzheimer, associado à expressão elevada da proteína BACE1, leva à acumulação dos péptidos Aß, que podem depositar, conduzindo à degeneração dos neurónios, comprometendo a função cognitiva. Logo este pre-miRNA-29b pode ser considerado como potencial biomarcador ou agente terapêutico para esta doença. Mas neste momento a produção em larga escala de RNA para aplicações terapêuticas envolve um processo complexo que exige estratégias de produção e purificação eficientes e controlo de qualidade rigoroso para garantir a pureza e a atividade biológica do RNA. No entanto, os métodos mais comuns para a produção de RNA são a síntese química ou enzimática, que apresentam limitações em termos de quantidade e qualidade do RNA produzido. Nesse contexto, a produção recombinante pode ser uma alternativa para superar alguns desses desafios, uma vez que é um método mais económico e de fácil transposição para larga escala. Foi escolhida a bactéria Rhodovulum sulfidophilum, que é uma bactéria púrpura marinha, que apresenta a vantagem de secretar RNAs para o meio extracelular, sem libertar RNases. Com isso, a recuperação do RNA pode ser consideravelmente simplificada em comparação com os protocolos padrão de extração intracelular, facilitando o subsequente processo de purificação, que é a etapa mais crítica e dispendiosa de todo o processo de preparação de RNAs. Este trabalho teve como foco a otimização da produção extracelular de pre-miRNA-29 assim como a sua subsequente purificação. As condições de crescimento bacteriano foram otimizadas de forma a garantir os níveis máximos da molécula alvo, monitorizando a produção em diferentes tempos de cultura (24 h, 36 h, 48 h e 60 h) e usando diferentes temperaturas (25 ºC, 30 ºC e 37 ºC) para o crescimento bacteriano. De modo geral, os níveis mais elevados de pre-miRNA-29b foram obtidos após 48 horas de crescimento a 25 ºC (0.23 ng/mL de meio), porém, para a continuidade dos estudos, foi escolhida a segunda melhor condição, de 36 horas de cultura a 30 ºC (0.08 ng/mL de meio), uma vez que o erro associado às medições nesta condição era menor, e consistia num tempo de cultura mais curto, rentabilizando assim a duração do processo. Quanto à purificação do pre-miRNA-29b, foi selecionado um suporte cromatográfico multimodal, Capto Q Impres, que demonstrou um desempenho promissor na interação seletiva com o RNA alvo. Realizou-se uma otimização inicial para avaliar o impacto da concentração de NaCl nas etapas de ligação e eluição, assim com o pH usado (7 ou 8) Adicionalmente, foi testado o efeito da pré-purificação da amostra por cromatografia de exclusão molecular e também analisada a importância de concentração da amostra antes de prosseguir para o passo de purificação. Foram ainda realizadas comparações quanto à massa de amostra aplicada na coluna, bem como a análise das diferenças entre as amostras intracelulares e extracelulares. Após a avaliação preliminar, foi aplicado um DoE na tentativa de melhorar o desempenho do processo de purificação. Os parâmetros de otimização incluíram a concentração de NaCl durante as etapas de equilíbrio e eluição, bem como o pH do tampão. Desta forma foi possível otimizar o processo de produção extracelular de pre-miRNA-29b em Rhodovulum sulfidophilum e também desenvolver um processo promissor para a sua posterior purificação.
Autores principais:	Bento, José Pedro Santos
Assunto:	Desenho Experimental Pre-Mirna-29b Produção Recombinante Purificação Rhodovulum Sulfidophilum
Ano:	2024
País:	Portugal
Tipo de documento:	dissertação de mestrado
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	Universidade da Beira Interior
Idioma:	inglês
Origem:	uBibliorum

Descrição
Resumo:	A terapia baseada em RNA tem avançado rapidamente, trazendo desenvolvimentos promissores para o tratamento de diversas doenças. Os RNAs podem ser divididos em codificantes e não codificantes (ncRNAs), sendo que os não codificantes têm vindo a ganhar grande interesse visto que possuem a função de regulação da expressão génica. Os microRNAs (miRNAs ou miRs) são um exemplo de ncRNAs, que regulam a expressão génica a nível pós-transcricional e controlam processos biológicos com precisão notável, ligando-se de forma complementar aos mRNAs alvo, modulando assim a expressão génica. O pre-miRNA-29b é um desses miRNAs e já é reconhecido por estar envolvido nos mecanismos patológicos associados à doença de Alzheimer. Neste caso, os baixos níveis de miRNA-29b em doentes de Alzheimer, associado à expressão elevada da proteína BACE1, leva à acumulação dos péptidos Aß, que podem depositar, conduzindo à degeneração dos neurónios, comprometendo a função cognitiva. Logo este pre-miRNA-29b pode ser considerado como potencial biomarcador ou agente terapêutico para esta doença. Mas neste momento a produção em larga escala de RNA para aplicações terapêuticas envolve um processo complexo que exige estratégias de produção e purificação eficientes e controlo de qualidade rigoroso para garantir a pureza e a atividade biológica do RNA. No entanto, os métodos mais comuns para a produção de RNA são a síntese química ou enzimática, que apresentam limitações em termos de quantidade e qualidade do RNA produzido. Nesse contexto, a produção recombinante pode ser uma alternativa para superar alguns desses desafios, uma vez que é um método mais económico e de fácil transposição para larga escala. Foi escolhida a bactéria Rhodovulum sulfidophilum, que é uma bactéria púrpura marinha, que apresenta a vantagem de secretar RNAs para o meio extracelular, sem libertar RNases. Com isso, a recuperação do RNA pode ser consideravelmente simplificada em comparação com os protocolos padrão de extração intracelular, facilitando o subsequente processo de purificação, que é a etapa mais crítica e dispendiosa de todo o processo de preparação de RNAs. Este trabalho teve como foco a otimização da produção extracelular de pre-miRNA-29 assim como a sua subsequente purificação. As condições de crescimento bacteriano foram otimizadas de forma a garantir os níveis máximos da molécula alvo, monitorizando a produção em diferentes tempos de cultura (24 h, 36 h, 48 h e 60 h) e usando diferentes temperaturas (25 ºC, 30 ºC e 37 ºC) para o crescimento bacteriano. De modo geral, os níveis mais elevados de pre-miRNA-29b foram obtidos após 48 horas de crescimento a 25 ºC (0.23 ng/mL de meio), porém, para a continuidade dos estudos, foi escolhida a segunda melhor condição, de 36 horas de cultura a 30 ºC (0.08 ng/mL de meio), uma vez que o erro associado às medições nesta condição era menor, e consistia num tempo de cultura mais curto, rentabilizando assim a duração do processo. Quanto à purificação do pre-miRNA-29b, foi selecionado um suporte cromatográfico multimodal, Capto Q Impres, que demonstrou um desempenho promissor na interação seletiva com o RNA alvo. Realizou-se uma otimização inicial para avaliar o impacto da concentração de NaCl nas etapas de ligação e eluição, assim com o pH usado (7 ou 8) Adicionalmente, foi testado o efeito da pré-purificação da amostra por cromatografia de exclusão molecular e também analisada a importância de concentração da amostra antes de prosseguir para o passo de purificação. Foram ainda realizadas comparações quanto à massa de amostra aplicada na coluna, bem como a análise das diferenças entre as amostras intracelulares e extracelulares. Após a avaliação preliminar, foi aplicado um DoE na tentativa de melhorar o desempenho do processo de purificação. Os parâmetros de otimização incluíram a concentração de NaCl durante as etapas de equilíbrio e eluição, bem como o pH do tampão. Desta forma foi possível otimizar o processo de produção extracelular de pre-miRNA-29b em Rhodovulum sulfidophilum e também desenvolver um processo promissor para a sua posterior purificação.

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