Publicação
Characterization and development towards electrochemical real-time LAMP detection in an integrated and portable device
| Resumo: | Nos últimos anos os biossensores eletroquímicos têm sido reportados como uma abordagem promis sora para a deteção de DNA. São atrativos para dispositivos point-of-care pela facilidade de miniaturização, compatibilidade com técnicas de microfabricação e facilidade de instrumentação. Contudo, a integração de uma fase de amplificação com a deteção de sinais continua a ser um desafio. A técnica LAMP (loop mediated isothermal amplification ) surgiu como solução, destacando-se pela sua robustez e sensibilidade. Uma plataforma portátil para deteção eletroquímica de DNA (Mobi-E) foi desenvolvida para incorporar as caraterísticas mencionadas. Neste trabalho foram caraterizados os principais componentes do disposi tivo: potencióstatos ASIC, controlo de temperatura e um chip fluídico que integra elétrodos e estruturas de aquecimento impressas. Seguidamente, efetuou-se uma pesquisa para funcionalização universal desses elétrodos utilizando MD LAMP (mediator displacement LAMP). O desempenho do potencióstato, especificamente a rotina de voltametria de onda quadrada e a leitura quase simultânea dos 6 elétrodos de trabalho de uma câmara, foi provado e comparado com um dispositivo comercial, obtendo-se resultados qualitativamente comparáveis. Foram ainda realizadas otimizações para estabilização do potencial de referência, através da conversão Ag/AgCl por FeCl3, e para precaver dificuldades de medição resultantes da limitada tensão de conformidade do potencióstato (1.8 V). Para tal, aumentou-se a área do elétrodo auxiliar, através da impressão de 8 camadas de Au (4 no elétrodo de trabalho), e efetuou-se, entre medições, o curto-circuito entre o elétrodo auxiliar e o de referência. O sistema de controlo de temperatura provou ser efetivo no aquecimento das câmaras até 65 ºC em 2.5 min e na monitorização assertiva das suas temperaturas. Não foi detetado cross-talk entre câmaras vizinhas, nem a formação severa de bolhas de ar. Como prova de conceito, foram testadas quatro abordagens para MD LAMP e foi identificada uma alternativa promissora (Stem-Loop ) ao standard, com a respetiva mudança relativa de sinal: 0.3 e 177.6. Esta dissertação culmina com a otimização da reação LAMP para uma libertação eficiente do medi ador. Duas promissoras combinações de concentrações de mediador, primer modificado e loop primer foram identificadas: 200 nM, 400 nM, 400 nM e 100 nM, 200 nM, 600 nM, respetivamente, obtendo-se uma relação sinal/ruído de 3.7 e 2.9. Os conhecimentos adquiridos viabilizam o avanço da investigação no sentido da obtenção de um dispositivo capaz de realizar LAMP eletroquímico em tempo real. |
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| Autores principais: | Gonçalves, Vanessa Matos |
| Assunto: | Biossensor Deteção eletroquímica LAMP em tempo real Testes de amplificação de ácidos núcleicos Biosensor Electrochemical detection Nucleic acid amplification tests Real-time LAMP Engenharia e Tecnologia::Engenharia Médica |
| Ano: | 2022 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade do Minho |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | RepositóriUM - Universidade do Minho |
| Resumo: | Nos últimos anos os biossensores eletroquímicos têm sido reportados como uma abordagem promis sora para a deteção de DNA. São atrativos para dispositivos point-of-care pela facilidade de miniaturização, compatibilidade com técnicas de microfabricação e facilidade de instrumentação. Contudo, a integração de uma fase de amplificação com a deteção de sinais continua a ser um desafio. A técnica LAMP (loop mediated isothermal amplification ) surgiu como solução, destacando-se pela sua robustez e sensibilidade. Uma plataforma portátil para deteção eletroquímica de DNA (Mobi-E) foi desenvolvida para incorporar as caraterísticas mencionadas. Neste trabalho foram caraterizados os principais componentes do disposi tivo: potencióstatos ASIC, controlo de temperatura e um chip fluídico que integra elétrodos e estruturas de aquecimento impressas. Seguidamente, efetuou-se uma pesquisa para funcionalização universal desses elétrodos utilizando MD LAMP (mediator displacement LAMP). O desempenho do potencióstato, especificamente a rotina de voltametria de onda quadrada e a leitura quase simultânea dos 6 elétrodos de trabalho de uma câmara, foi provado e comparado com um dispositivo comercial, obtendo-se resultados qualitativamente comparáveis. Foram ainda realizadas otimizações para estabilização do potencial de referência, através da conversão Ag/AgCl por FeCl3, e para precaver dificuldades de medição resultantes da limitada tensão de conformidade do potencióstato (1.8 V). Para tal, aumentou-se a área do elétrodo auxiliar, através da impressão de 8 camadas de Au (4 no elétrodo de trabalho), e efetuou-se, entre medições, o curto-circuito entre o elétrodo auxiliar e o de referência. O sistema de controlo de temperatura provou ser efetivo no aquecimento das câmaras até 65 ºC em 2.5 min e na monitorização assertiva das suas temperaturas. Não foi detetado cross-talk entre câmaras vizinhas, nem a formação severa de bolhas de ar. Como prova de conceito, foram testadas quatro abordagens para MD LAMP e foi identificada uma alternativa promissora (Stem-Loop ) ao standard, com a respetiva mudança relativa de sinal: 0.3 e 177.6. Esta dissertação culmina com a otimização da reação LAMP para uma libertação eficiente do medi ador. Duas promissoras combinações de concentrações de mediador, primer modificado e loop primer foram identificadas: 200 nM, 400 nM, 400 nM e 100 nM, 200 nM, 600 nM, respetivamente, obtendo-se uma relação sinal/ruído de 3.7 e 2.9. Os conhecimentos adquiridos viabilizam o avanço da investigação no sentido da obtenção de um dispositivo capaz de realizar LAMP eletroquímico em tempo real. |
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Atividades financiadas
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