Publicação

Internalização e sobrevivência intracelular de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) em enterócitos humanos cultivados in vitro

Detalhes bibliográficos
Resumo:	Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) causam doença em humanos e animais. Além de doença diarreica, determinam complicações sistêmicas como síndrome hemolítica urêmica (SHU), púrpura trombótica trombocitopênica ou ainda sequelas como hipertensão arterial e isquemia miocárdica, entre outras. A ampla distribuição de STEC no trato gastrointestinal de uma variedade de animais, particularmente bovinos e outros ruminantes, indica o caráter zoonótico da doença. STEC, além de colonizarem bovinos, podem contaminar alimentos como a carne e o leite e sobreviver no solo, esterco, pastagens e na água, importantes veículos para a sua transmissão. A maioria das cepas STEC invadem enterócitos e podem persistir intracelularmente. Há evidências de que a localização intracelular de STEC constituiria uma estratégia eficiente para a colonização do animal hospedeiro. Alguns patógenos têm a capacidade de explorar as vias endocíticas da célula hospedeira para a sua internalização. Embora muito se saiba quanto aos conteúdos e as estruturas endocíticas, pouco se sabe sobre os mecanismos de endocitose específicos pelos quais estes conteúdos são recrutados e internalizados. No presente estudo foram investigados aspectos da invasão de células Caco-2 por cepas STEC representativas de alguns sorotipos envolvidos em doença humana, como EDL931 (O157:H7), 282/2 (O8:H19) e 784/1 (O113:H21). Foram empregados testes de inibição da invasão bacteriana por drogas que interferem em vias endocíticas (cloridrato de clorpromazina, metil-β-ciclodextrina e filipina ) e imunofluorescência para a detecção de proteínas marcadoras de endossomas precoces (Rab5, EEA-1) endossomas tardios (Rab7) e lisossomos (LAMP1), além da sonda LysoTracker Red DND-99. A clorpromazina foi eficiente na inibição da atividade invasora de todas as cepas STEC, caracterizando o envolvimento da via da clatrina na internalização de STEC, pelo mecanismo de zippering. Para algumas cepas (sorotipos O157:H7 e O113:H21) um segundo mecanismo, via lipid rafts/caveolina pareceu também participar. Todas as cepas mostraram colocalização com os marcadores EEA-1, Rab7 e LAMP1, mas não com Rab5. A colocalização com Rab 7, marcador de endossomas tardios só ocorreu 3 horas pós-infecção, sendo possível que este tempo contribua para retardar a fusão dos fagossomas aos lisossomos, favorecendo a sobrevivência e multiplicação inicial do microrganismo. Entre 1 e 3 horas pós-infecção, apenas parte dos fagossomos contendo STEC demonstrou marcação por LAMP1 e fusão com lisossomos, avaliada pelo uso da sonda LysoTracker Red DND-99. Nesta etapa da infecção foram encontradas numerosas bactérias íntegras em fagossomas não marcados com LAMP-1 ou com a sonda. Já em fase tardia da infecção (48 horas), ocorreu uma redução no número de bactérias intracelulares e apenas uma minoria destas não associada a lisossomos, conservando a sua integridade estrutural. Estes resultados sugerem que uma subpopulação das STEC intracelulares sobrevive e persiste, evitando de alguma forma a sua destruição pelos lisossomas. Tal característica pode ser relevante para a prolongada persistência de STEC no hospedeiro animal.
Autores principais:	Prado, Esther Helena Rondon Barretto
Assunto:	STEC internalization Endocytosis pathways Inhibitory drugs of endocytic pathways Endosome markers Immunofluorescence microscopy Internalização de STEC Mecanismos de endocitose Drogas inibidoras de vias endocíticas Marcadores de endossomos Microscopia de imunofluorescencia Escherichia coli Toxinas bacterianas Escherichia coli Shiga Toxigênica Endocitose CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::MICROBIOLOGIA APLICADA
Ano:	2021
País:	Brasil
Tipo de documento:	tese de doutoramento
Tipo de acesso:	acesso aberto
Instituição associada:	IBICT
Idioma:	português
Origem:	Oasisbr

Descrição
Resumo:	Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) causam doença em humanos e animais. Além de doença diarreica, determinam complicações sistêmicas como síndrome hemolítica urêmica (SHU), púrpura trombótica trombocitopênica ou ainda sequelas como hipertensão arterial e isquemia miocárdica, entre outras. A ampla distribuição de STEC no trato gastrointestinal de uma variedade de animais, particularmente bovinos e outros ruminantes, indica o caráter zoonótico da doença. STEC, além de colonizarem bovinos, podem contaminar alimentos como a carne e o leite e sobreviver no solo, esterco, pastagens e na água, importantes veículos para a sua transmissão. A maioria das cepas STEC invadem enterócitos e podem persistir intracelularmente. Há evidências de que a localização intracelular de STEC constituiria uma estratégia eficiente para a colonização do animal hospedeiro. Alguns patógenos têm a capacidade de explorar as vias endocíticas da célula hospedeira para a sua internalização. Embora muito se saiba quanto aos conteúdos e as estruturas endocíticas, pouco se sabe sobre os mecanismos de endocitose específicos pelos quais estes conteúdos são recrutados e internalizados. No presente estudo foram investigados aspectos da invasão de células Caco-2 por cepas STEC representativas de alguns sorotipos envolvidos em doença humana, como EDL931 (O157:H7), 282/2 (O8:H19) e 784/1 (O113:H21). Foram empregados testes de inibição da invasão bacteriana por drogas que interferem em vias endocíticas (cloridrato de clorpromazina, metil-β-ciclodextrina e filipina ) e imunofluorescência para a detecção de proteínas marcadoras de endossomas precoces (Rab5, EEA-1) endossomas tardios (Rab7) e lisossomos (LAMP1), além da sonda LysoTracker Red DND-99. A clorpromazina foi eficiente na inibição da atividade invasora de todas as cepas STEC, caracterizando o envolvimento da via da clatrina na internalização de STEC, pelo mecanismo de zippering. Para algumas cepas (sorotipos O157:H7 e O113:H21) um segundo mecanismo, via lipid rafts/caveolina pareceu também participar. Todas as cepas mostraram colocalização com os marcadores EEA-1, Rab7 e LAMP1, mas não com Rab5. A colocalização com Rab 7, marcador de endossomas tardios só ocorreu 3 horas pós-infecção, sendo possível que este tempo contribua para retardar a fusão dos fagossomas aos lisossomos, favorecendo a sobrevivência e multiplicação inicial do microrganismo. Entre 1 e 3 horas pós-infecção, apenas parte dos fagossomos contendo STEC demonstrou marcação por LAMP1 e fusão com lisossomos, avaliada pelo uso da sonda LysoTracker Red DND-99. Nesta etapa da infecção foram encontradas numerosas bactérias íntegras em fagossomas não marcados com LAMP-1 ou com a sonda. Já em fase tardia da infecção (48 horas), ocorreu uma redução no número de bactérias intracelulares e apenas uma minoria destas não associada a lisossomos, conservando a sua integridade estrutural. Estes resultados sugerem que uma subpopulação das STEC intracelulares sobrevive e persiste, evitando de alguma forma a sua destruição pelos lisossomas. Tal característica pode ser relevante para a prolongada persistência de STEC no hospedeiro animal.

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