Publicação
Establishment of a 3D multi-layered intestinal inflammation model
| Resumo: | A Doença de Crohn e a Colite Ulcerosa são os principais tipos da Doença Inflamatória Intestinal (DII). Estas doenças inflamatórias intestinais são altamente debilitantes e uma cura definitiva não está disponível nas clínicas. O estabelecimento de modelos in vitro confiáveis e úteis da barreira intestinal inflamada para agilizar e validar o desenvolvimento de terapias para a DII é, portanto, de extrema relevância. O nosso grupo de investigação estabeleceu anteriormente um modelo de cultura de células tridimensional (3D) de intestino saudável, que compreende uma barreira endotelial, composta por células HPMEC-ST1.6R, uma camada à base de colagénio que incorpora fibroblastos intestinais humanos (HIFs) e, por último a camada epitelial, composta por células Caco-2 e células HT29-MTX produtoras de muco. Vendo as falhas existentes na representação in vitro do ambiente inflamatório, propomos melhorar este modelo 3D através da adição de células THP-1 (mimetizando o fenótipo dos macrófagos) na lâmina própria para mimetizar as principais características da inflamação e aumentar a complexidade do modelo e interação célula a célula.O estabelecimento de uma camada 3D de colagénio com células HIF e dTHP-1 para mimetizar a lâmina própria exigiu primeiro a diferenciação de células THP-1 em macrófagos. A camada de colagénio 3D com células HIF e dTHP-1 foi alcançada com uma concentração de colagénio de 6 mg/mL, uma densidade inicial de HIF de 5 x 104 células/mL e uma densidade inicial de THP-1/dTHP-1 de 2,5 x 105 células/mL. Para caracterizar esta camada, a atividade metabólica ao longo do tempo foi avaliada. Para além disso, coloração por hematoxilina e eosina, análise por imunohistoquímica das diferentes populações celulares e ensaios de viabilidade celular foram também realizados. Os resultados da atividade metabólica mostraram que os fibroblastos e macrófagos estavam ativos dentro dos géis, indicando que estavam saudáveis e a proliferar. Após o estabelecimento bem-sucedido da camada 3D de colagénio com HIF e dTHP-1, a inflamação foi induzida com LPS. Os resultados mostram que os valores de TEER foram mantidos após a indução da inflamação. No modelo 3D tratado com LPS, a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6) foi significativamente aumentada, em comparação com o modelo 3D sem LPS. Como houve aumento da citocina pró-inflamatória IL-6 no modelo 3D com LPS, a inflamação foi induzida.Em conclusão, acreditamos que este modelo 3D de inflamação intestinal tem potencial para ajudar a preencher a lacuna entre testes in vitro e in vivo, o que pode ter um grande impacto no ramo do desenvolvimento de medicamentos e, com isso, contribuir para a política de substituição, redução e refinamento (3Rs), principalmente pela redução do número de experiências com animais. |
|---|---|
| Autores principais: | Ferreira, Bárbara Ribeiro Costa |
| Assunto: | Modelos 3D intestinais Modelos in vitro Co-cultura Doença Inflamatória Intestinal Inflamação Intestinal 3D models In vitro models Co-culture Inflammatory bowel disease Inflammation |
| Ano: | 2022 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | dissertação de mestrado |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Coimbra |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Estudo Geral - Universidade de Coimbra |
| Resumo: | A Doença de Crohn e a Colite Ulcerosa são os principais tipos da Doença Inflamatória Intestinal (DII). Estas doenças inflamatórias intestinais são altamente debilitantes e uma cura definitiva não está disponível nas clínicas. O estabelecimento de modelos in vitro confiáveis e úteis da barreira intestinal inflamada para agilizar e validar o desenvolvimento de terapias para a DII é, portanto, de extrema relevância. O nosso grupo de investigação estabeleceu anteriormente um modelo de cultura de células tridimensional (3D) de intestino saudável, que compreende uma barreira endotelial, composta por células HPMEC-ST1.6R, uma camada à base de colagénio que incorpora fibroblastos intestinais humanos (HIFs) e, por último a camada epitelial, composta por células Caco-2 e células HT29-MTX produtoras de muco. Vendo as falhas existentes na representação in vitro do ambiente inflamatório, propomos melhorar este modelo 3D através da adição de células THP-1 (mimetizando o fenótipo dos macrófagos) na lâmina própria para mimetizar as principais características da inflamação e aumentar a complexidade do modelo e interação célula a célula.O estabelecimento de uma camada 3D de colagénio com células HIF e dTHP-1 para mimetizar a lâmina própria exigiu primeiro a diferenciação de células THP-1 em macrófagos. A camada de colagénio 3D com células HIF e dTHP-1 foi alcançada com uma concentração de colagénio de 6 mg/mL, uma densidade inicial de HIF de 5 x 104 células/mL e uma densidade inicial de THP-1/dTHP-1 de 2,5 x 105 células/mL. Para caracterizar esta camada, a atividade metabólica ao longo do tempo foi avaliada. Para além disso, coloração por hematoxilina e eosina, análise por imunohistoquímica das diferentes populações celulares e ensaios de viabilidade celular foram também realizados. Os resultados da atividade metabólica mostraram que os fibroblastos e macrófagos estavam ativos dentro dos géis, indicando que estavam saudáveis e a proliferar. Após o estabelecimento bem-sucedido da camada 3D de colagénio com HIF e dTHP-1, a inflamação foi induzida com LPS. Os resultados mostram que os valores de TEER foram mantidos após a indução da inflamação. No modelo 3D tratado com LPS, a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6) foi significativamente aumentada, em comparação com o modelo 3D sem LPS. Como houve aumento da citocina pró-inflamatória IL-6 no modelo 3D com LPS, a inflamação foi induzida.Em conclusão, acreditamos que este modelo 3D de inflamação intestinal tem potencial para ajudar a preencher a lacuna entre testes in vitro e in vivo, o que pode ter um grande impacto no ramo do desenvolvimento de medicamentos e, com isso, contribuir para a política de substituição, redução e refinamento (3Rs), principalmente pela redução do número de experiências com animais. |
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Atividades financiadas
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