Publicação
Allergic Contact Dermatitis: From the identification of skin sensitizers to the development of new preventive strategies
| Resumo: | A dermatite alérgica de contato (DCA), é uma manifestação clínica da sensibilização da pele, e a doença ocupacional mais prevalente em humanos, com uma taxa de prevalência de 27% na Europa e entre 15-20% na população em geral. Esta elevada prevalência, aliada ao número crescente de sensibilizantes cutâneos a que a humanidade está exposta e à ausência de estratégias terapêuticas eficazes, não só resulta num elevado custo para o sistema de saúde como afeta fortemente a qualidade de vida dos doentes, destacando a relevância e a falta de desenvolvimento de novas e efetivas estratégias preventivas.A identificação de potenciais sensibilizantes cutâneos tem se baseado fortemente em métodos in vivo, embora grandes esforços de investigação estão a ser feitos para o desenvolvimento de novas metodologias de abordagem (NAMs). De fato, testes em animais na União Europeia encontram-se proibidos desde 2004 para produtos cosméticos (“testing ban”). Consequentemente, o desenvolvimento de NAM para sensibilização da pele foi incentivado e esforços consideráveis foram feitos. Os NAM disponíveis foram desenvolvidos com base no “Adverse Outcome Pathway” (AOP) da sensibilização da pele, que fornece a base mecanicista para a integração de informações relacionadas à sensibilização da pele. Os principais eventos na AOP incluem a ligação covalente de um produto químico às proteínas da pele, ativação de queratinócitos, ativação de células dendríticas e ativação e proliferação de células T, levando à sensibilização da pele. Por exemplo, está bem estabelecido que a conjugação químico-peptídeo representa o evento de iniciação molecular (MIE) na sensibilização da pele e este MIE tem sido explorado com sucesso no desenvolvimento de ensaios de reatividade peptídica in chemico, com o Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) sendo validado como uma ferramenta de triagem para perigo de sensibilização da pele, bem como uma diretriz de teste da OCDE. Este teste baseia-se no uso de cromatografia líquida de alta performance/método de deteção ultravioleta para quantificar a conjugação químico-peptídeo por meio da medição da depleção de dois peptídeos sintéticos contendo resíduos de lisina ou cisteína, sendo trabalhoso e demorado. Para melhorar o rendimento, sensibilidade e a precisão do ensaio, o capítulo 2 da tese consiste no desenvolvimento de um ensaio espectrofotométrico para o potencial de sensibilização da pele baseado na medição do MIE, que é uma alternativa mais barata, rápida, simples e acessível para o DPRA, fornecendo resultados comparáveis. O mesmo foi novamente utilizado no capítulo seguinte da tese.Deste modo, o capítulo 3 teve como objetivo divulgar moléculas capazes de evitar o “AOP” por alérgenos cutâneos humanos padrão, usando NAM para risco de sensibilização cutânea, em particular um teste desenvolvido internamente, a maturação (in vitro) de células THP-1 analisados pela regulação positiva das moléculas co estimuladoras CD86 e CD54 e pela expressão de genes dependentes de NRF2 em queratinócitos. Usando esses NAMs, a condição de lisina e N-acetilcisteína (NAC+LYS) foi a mais eficiente na mitigação de todos os principais eventos evocados por alérgenos cutâneos DNFB e MI e, portanto, selecionados para serem formulados e testados in vivo. Assim, dando um passo à frente, o efeito preventivo de um hidrogel contendo NAC mais LYS (desenvolvido no capítulo 4) foi o ensaio do linfonodo local murino (LLNA: BrdU-FCM), previamente aprovado pela OCDE para esse fim. Os resultados alcançados demonstraram que o hidrogel formulado com NAC mais LYS pode diminuir o índice de estimulação (SI) desencadeado por fortes alérgenos cutâneos e, consequentemente, a magnitude da sensibilização cutânea. Adicionalmente, a pré-aplicação do hidrogel reduziu significativamente o inchaço, espessura e inflamação da orelha do ratinho e as análises histológicas, realizadas em colaboração com o serviço de Anatomia Patológica do CHUC, também confirmaram o efeito protetor do hidrogel.Finalmente, o capítulo 4 descreve o desenvolvimento e caracterização de um novo hidrogel contendo os ingredientes ativos NAC mais LYS sob as premissas de qualidade e segurança desde o projeto. Dois planos fatoriais foram estabelecidos visando a otimização do hidrogel em termos de propriedades mecânicas e reológicas. Estudos de liberação e permeação in vitro suportaram e confirmaram o efeito de barreira na superfície da pele. Para além disso, o hidrogel selecionado demonstrou ser seguro sem causar irritação ou sensibilização da pele humana.De modo geral, o trabalho experimental desenvolvido nesta tese permitiu identificar moléculas capazes de bloquear/atenuar cada um dos eventos-chave da sensibilização da pele do AOP, dando um forte contributo para o campo da dermatite alérgica de contacto, uma patologia sem cura e a forma mais comum de imunotoxicidade nos humanos. |
|---|---|
| Autores principais: | Brites, Gonçalo Sousa |
| Assunto: | barreira química dermatite de contacto alérgica estratégia preventiva hidrogel sensibilização cutânea Preventive strategy Skin sensitization allergic contact dermaitits chemical Barrier hydrogel |
| Ano: | 2024 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | tese de doutoramento |
| Tipo de acesso: | acesso embargado |
| Instituição associada: | Universidade de Coimbra |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Estudo Geral - Universidade de Coimbra |
| Resumo: | A dermatite alérgica de contato (DCA), é uma manifestação clínica da sensibilização da pele, e a doença ocupacional mais prevalente em humanos, com uma taxa de prevalência de 27% na Europa e entre 15-20% na população em geral. Esta elevada prevalência, aliada ao número crescente de sensibilizantes cutâneos a que a humanidade está exposta e à ausência de estratégias terapêuticas eficazes, não só resulta num elevado custo para o sistema de saúde como afeta fortemente a qualidade de vida dos doentes, destacando a relevância e a falta de desenvolvimento de novas e efetivas estratégias preventivas.A identificação de potenciais sensibilizantes cutâneos tem se baseado fortemente em métodos in vivo, embora grandes esforços de investigação estão a ser feitos para o desenvolvimento de novas metodologias de abordagem (NAMs). De fato, testes em animais na União Europeia encontram-se proibidos desde 2004 para produtos cosméticos (“testing ban”). Consequentemente, o desenvolvimento de NAM para sensibilização da pele foi incentivado e esforços consideráveis foram feitos. Os NAM disponíveis foram desenvolvidos com base no “Adverse Outcome Pathway” (AOP) da sensibilização da pele, que fornece a base mecanicista para a integração de informações relacionadas à sensibilização da pele. Os principais eventos na AOP incluem a ligação covalente de um produto químico às proteínas da pele, ativação de queratinócitos, ativação de células dendríticas e ativação e proliferação de células T, levando à sensibilização da pele. Por exemplo, está bem estabelecido que a conjugação químico-peptídeo representa o evento de iniciação molecular (MIE) na sensibilização da pele e este MIE tem sido explorado com sucesso no desenvolvimento de ensaios de reatividade peptídica in chemico, com o Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) sendo validado como uma ferramenta de triagem para perigo de sensibilização da pele, bem como uma diretriz de teste da OCDE. Este teste baseia-se no uso de cromatografia líquida de alta performance/método de deteção ultravioleta para quantificar a conjugação químico-peptídeo por meio da medição da depleção de dois peptídeos sintéticos contendo resíduos de lisina ou cisteína, sendo trabalhoso e demorado. Para melhorar o rendimento, sensibilidade e a precisão do ensaio, o capítulo 2 da tese consiste no desenvolvimento de um ensaio espectrofotométrico para o potencial de sensibilização da pele baseado na medição do MIE, que é uma alternativa mais barata, rápida, simples e acessível para o DPRA, fornecendo resultados comparáveis. O mesmo foi novamente utilizado no capítulo seguinte da tese.Deste modo, o capítulo 3 teve como objetivo divulgar moléculas capazes de evitar o “AOP” por alérgenos cutâneos humanos padrão, usando NAM para risco de sensibilização cutânea, em particular um teste desenvolvido internamente, a maturação (in vitro) de células THP-1 analisados pela regulação positiva das moléculas co estimuladoras CD86 e CD54 e pela expressão de genes dependentes de NRF2 em queratinócitos. Usando esses NAMs, a condição de lisina e N-acetilcisteína (NAC+LYS) foi a mais eficiente na mitigação de todos os principais eventos evocados por alérgenos cutâneos DNFB e MI e, portanto, selecionados para serem formulados e testados in vivo. Assim, dando um passo à frente, o efeito preventivo de um hidrogel contendo NAC mais LYS (desenvolvido no capítulo 4) foi o ensaio do linfonodo local murino (LLNA: BrdU-FCM), previamente aprovado pela OCDE para esse fim. Os resultados alcançados demonstraram que o hidrogel formulado com NAC mais LYS pode diminuir o índice de estimulação (SI) desencadeado por fortes alérgenos cutâneos e, consequentemente, a magnitude da sensibilização cutânea. Adicionalmente, a pré-aplicação do hidrogel reduziu significativamente o inchaço, espessura e inflamação da orelha do ratinho e as análises histológicas, realizadas em colaboração com o serviço de Anatomia Patológica do CHUC, também confirmaram o efeito protetor do hidrogel.Finalmente, o capítulo 4 descreve o desenvolvimento e caracterização de um novo hidrogel contendo os ingredientes ativos NAC mais LYS sob as premissas de qualidade e segurança desde o projeto. Dois planos fatoriais foram estabelecidos visando a otimização do hidrogel em termos de propriedades mecânicas e reológicas. Estudos de liberação e permeação in vitro suportaram e confirmaram o efeito de barreira na superfície da pele. Para além disso, o hidrogel selecionado demonstrou ser seguro sem causar irritação ou sensibilização da pele humana.De modo geral, o trabalho experimental desenvolvido nesta tese permitiu identificar moléculas capazes de bloquear/atenuar cada um dos eventos-chave da sensibilização da pele do AOP, dando um forte contributo para o campo da dermatite alérgica de contacto, uma patologia sem cura e a forma mais comum de imunotoxicidade nos humanos. |
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