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Unraveling the interplay between fibroblasts and osteosarcoma cells during lung metastasis formation
| Summary: | Introdução: O osteossarcoma (OS) é um tumor primário maligno que usualmente metastiza para o pulmão. Evidências crescentes sugerem que o tumor primário promove alterações fenotípicas nos fibroblastos pulmonares residentes, formando um nicho pré-metastático que favorece a colonização e desenvolvimento de metástases pulmonares. Posto isto, avaliámos a modulação do microambiente pulmonar e os efeitos recíprocos dos fibroblastos ativados sobre as células tumorais antes da colonização do pulmão. Materiais e métodos: Os pulmões foram recolhidos de murganhos não tratados, tratados com o secretoma das células 143B e de murganhos que possuíam um tumor primário subcutâneo. A modulação das proteínas da matriz extracelular (ECM), colagénio I/III e fibronectina foram avaliadas por imunohistoquímica e por western blot. Os fibroblastos pulmonares foram isolados a partir das três diferentes condições e avaliada a expressão de marcadores de ativação (α-SMA, vimentina e fibronectina) por imunocitoquímica e western blot. A capacidade de migração dos fibroblastos pulmonares também foi avaliada por um ensaio de scratch. A expressão de citocinas inflamatórias foi avaliada por qRT-PCR tanto no tecido como nos fibroblastos pulmonares. Depois desta caracterização, as células 143B foram expostas ao secretoma dos fibroblastos normais (NFs), e dos fibroblastos ativados derivados de murganhos tratados com o secretoma das células 143B (NAFsSCR) e derivados de animais com um tumor primário (NAFsSCT) em diferentes tempos de incubação. A quimiosensibilidade destas células à doxorubicina foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico com resazurina, assim como, características estaminais analisadas por um ensaio de formação de esferas e a expressão de genes de pluripotência e genes alvo da via de sinalização Wnt por qRT-PCR. A indução do estado de dormência foi avaliada por western blot. A adesão das células tumorais à fibronectina foi analisada na presença e na ausência de um anticorpo neutralizador da integrina β1. Resultados: O tecido pulmonar recolhido dos dois modelos animais tratados mostrou um aumento na deposição de fibras de reticulina (colagénio I/III) e fibronectina, e os fibroblastos pulmonares expressaram α-SMA, vimentina e fibronectina, bem como, um aumento significativo de mediadores inflamatórios, sugerindo um estado de ativação. As células 143B tornaram-se mais resistentes à doxorubicina, após serem expostas ao secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT, e adquirem propriedades estaminais, nomeadamente uma elevada expressão de SOX2 e KLF4, bem como, um aumento na eficiência de formação de esferas e no seu diâmetro. Às 24h de incubação, as células 143B entraram num estado de dormência, mostrado pela elevada expressão de p-p38 e diminuta expressão da pERK, representado por um rácio que muda progressivamente para o seu inverso, promovendo um fenótipo proliferativo. O secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT também estimula a adesão das células tumorais à fibronectina, sendo esta ligação mediada pela integrina β1. Conclusões: As células 143B, através da secreção de biomoléculas, induzem alterações no parênquima pulmonar e promovem a ativação dos fibroblastos, que têm efeitos recíprocos nas células tumorais, favorecendo a sua resistência à quimioterapia, entrada num estado de dormência antes de iniciarem a sua proliferação e aumentam as suas propriedades de adesão. Estes resultados evidenciam a interação mútua entre os fibroblastos e as células tumorais antes do início da colonização do pulmão. Adicionalmente, alguns destes mecanismos mediados pelos fibroblastos podem representar potenciais alvos para prevenir a formação de metástases pulmonares. |
|---|---|
| Main Authors: | Ribeiro, Gabriela Sampaio |
| Subject: | Osteossarcoma Metástase pulmonar Nicho pré-metastático Fibroblastos Secretoma Osteosarcoma Lung metastasis Pre-metastatic niche Fibroblasts Secretome |
| Year: | 2021 |
| Country: | Portugal |
| Document type: | master thesis |
| Access type: | embargoed access |
| Associated institution: | Universidade de Coimbra |
| Language: | English |
| Origin: | Estudo Geral - Universidade de Coimbra |
| Summary: | Introdução: O osteossarcoma (OS) é um tumor primário maligno que usualmente metastiza para o pulmão. Evidências crescentes sugerem que o tumor primário promove alterações fenotípicas nos fibroblastos pulmonares residentes, formando um nicho pré-metastático que favorece a colonização e desenvolvimento de metástases pulmonares. Posto isto, avaliámos a modulação do microambiente pulmonar e os efeitos recíprocos dos fibroblastos ativados sobre as células tumorais antes da colonização do pulmão. Materiais e métodos: Os pulmões foram recolhidos de murganhos não tratados, tratados com o secretoma das células 143B e de murganhos que possuíam um tumor primário subcutâneo. A modulação das proteínas da matriz extracelular (ECM), colagénio I/III e fibronectina foram avaliadas por imunohistoquímica e por western blot. Os fibroblastos pulmonares foram isolados a partir das três diferentes condições e avaliada a expressão de marcadores de ativação (α-SMA, vimentina e fibronectina) por imunocitoquímica e western blot. A capacidade de migração dos fibroblastos pulmonares também foi avaliada por um ensaio de scratch. A expressão de citocinas inflamatórias foi avaliada por qRT-PCR tanto no tecido como nos fibroblastos pulmonares. Depois desta caracterização, as células 143B foram expostas ao secretoma dos fibroblastos normais (NFs), e dos fibroblastos ativados derivados de murganhos tratados com o secretoma das células 143B (NAFsSCR) e derivados de animais com um tumor primário (NAFsSCT) em diferentes tempos de incubação. A quimiosensibilidade destas células à doxorubicina foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico com resazurina, assim como, características estaminais analisadas por um ensaio de formação de esferas e a expressão de genes de pluripotência e genes alvo da via de sinalização Wnt por qRT-PCR. A indução do estado de dormência foi avaliada por western blot. A adesão das células tumorais à fibronectina foi analisada na presença e na ausência de um anticorpo neutralizador da integrina β1. Resultados: O tecido pulmonar recolhido dos dois modelos animais tratados mostrou um aumento na deposição de fibras de reticulina (colagénio I/III) e fibronectina, e os fibroblastos pulmonares expressaram α-SMA, vimentina e fibronectina, bem como, um aumento significativo de mediadores inflamatórios, sugerindo um estado de ativação. As células 143B tornaram-se mais resistentes à doxorubicina, após serem expostas ao secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT, e adquirem propriedades estaminais, nomeadamente uma elevada expressão de SOX2 e KLF4, bem como, um aumento na eficiência de formação de esferas e no seu diâmetro. Às 24h de incubação, as células 143B entraram num estado de dormência, mostrado pela elevada expressão de p-p38 e diminuta expressão da pERK, representado por um rácio que muda progressivamente para o seu inverso, promovendo um fenótipo proliferativo. O secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT também estimula a adesão das células tumorais à fibronectina, sendo esta ligação mediada pela integrina β1. Conclusões: As células 143B, através da secreção de biomoléculas, induzem alterações no parênquima pulmonar e promovem a ativação dos fibroblastos, que têm efeitos recíprocos nas células tumorais, favorecendo a sua resistência à quimioterapia, entrada num estado de dormência antes de iniciarem a sua proliferação e aumentam as suas propriedades de adesão. Estes resultados evidenciam a interação mútua entre os fibroblastos e as células tumorais antes do início da colonização do pulmão. Adicionalmente, alguns destes mecanismos mediados pelos fibroblastos podem representar potenciais alvos para prevenir a formação de metástases pulmonares. |
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