Publicação
Genetic analysis of axon guidance mechanisms during ambryonic development of Drosophila melanogaster using DNA microarrays
| Resumo: | O cruzamento axonal da linha média durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central do embrião da Drosophila melanogaster envolve a participação de diversos receptores e ligandos. Muitas moléculas chave no direccionamento axonal foram identificadas em invertebrados e vertebrados, mas o papel da transcrição no controlo dos mecanismos de direccionamento axonal tem sido pouco estudado. Nesta dissertação efectuámos uma análise genómica global da regulação da transcrição em embriões de Drosophila, através da tecnologia de microarrays. Para o efeito usámos mutantes e transgénicos de direccionamento axonal, que se encontram bem caracterizados. Na tecnologia de microarrays da Affymetrix, algoritmos de Medidas de Expressão (ME) combinam os valores de várias sondas – correspondentes ao mesmo gene – num único valor. Neste trabalho avaliámos o desempenho de cinco MEs – MAS.5.0, dChip, RMA, PDNN e GCRMA – combinando análise estatística global com informação biol ógica conhecida. O uso de um estudo biológico – por oposição a um estudo de spike-in – permitiu avaliar as MEs em condições reais de preparação laboratorial. Os nossos resultados indicaram que RMA e PDNN são as ME mais equilibradas. MAS.5.0 é a ME menos fiável. dChip revela lacunas em algumas tarefas, enquanto que GCRMA apresenta falhas para valores de intensidade muito baixos. As experiências de microarrays produzem vastas quantidades de dados, sendo necessário algoritmos computacionais para analisar globalmente os resultados. Neste trabalho adaptámos o algoritmo de clustering HOPACH (Hierarchical Ordered Partitioning and Collapsing Hybrid), que combina as vantagens de algoritmos de partição e hierárquicos. A nossa adaptação de HOPACH identificou grupos pequenos e homogéneos, produzindo simultaneamente clusters grandes, de genes expressos de forma não diferencial. O nosso método elimina o passo de filtro, que reduz o número de genes interessantes. Caracterizámos os clusters resultantes de HOPACH relativamente à sua relevância no direccionamento axonal através de dois vocabulários controlados: Gene Ontology (GO) e as anotações anatómicas do Atlas of Pattern of Gene Expression (APoGE). Sugerimos vários genes candidatos para futuras experiências e provámos que a combinação de clustering com vocabulários controlados resultante da literatura e de padrões de expressão in situ é uma abordagem eficaz no estudo de redes de transcrição. O Cluster 49001 contém um número significativo de genes expressos em hemócitos – células sanguíneas da Drosophila. Observámos através de expressão de RNA que nos mutantes de slit e nos mutantes duplos de slit e robo a migração dos hemócitos não ocorre normalmente; surpreendentemente o duplo mutante para robo e robo2 – os receptores de slit – não apresenta o mesmo fenótipo para os hemócitos, o que sugere que a migração dos hemócitos poderá ocorrer através do envolvimento de slit, mas sem o envolvimento dos habituais receptores de slit. Há um conjunto de clusters enriquecido em ciclinas celulares, o que nos levou a examinar os padrões de expressão de RNA e proteína em mutantes e transgénicos de direccionamento axonal. Os resultados obtidos mostram que a sobre-expressão de robo é acompanhada por um aumento de RNA e proteína de várias ciclinas celulares; também observámos que as células que expressam ciclinas celulares estão anormalmente localizadas nos embriões de slit e robo12, encontrando-se afastadas da linha média. Estas duas observações sugerem um envolvimento, até ao momento desconhecido, das ciclinas celulares no direccionamento axonal. O resultado desta dissertação indica que a regulação da expressão genética tem um papel relevante no direccionamento axonal. Também encontrámos uma ligação entre direccionamento axonal e migração dos hemócitos, um resultado que está de acordo com resultados publicados recentemente [57] que indicam que moléculas de direccionamento axonal foram cooptadas durante a vascularização em vertebrados. Outra conclusão do nosso estudo aponta para a importância das ciclinas celulares no contexto do direccionamento axonal. Estes resultados ajudam a compreender melhor os mecanismos de regulação do direccionamento axonal in vivo. |
|---|---|
| Autores principais: | Magalhães, Luís Tiago Ferreira Romero |
| Assunto: | Biologia celular Drosophila melanogaster Direccionamento axonal |
| Ano: | 2007 |
| País: | Portugal |
| Tipo de documento: | tese de doutoramento |
| Tipo de acesso: | acesso aberto |
| Instituição associada: | Universidade de Coimbra |
| Idioma: | inglês |
| Origem: | Estudo Geral - Universidade de Coimbra |
| Resumo: | O cruzamento axonal da linha média durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central do embrião da Drosophila melanogaster envolve a participação de diversos receptores e ligandos. Muitas moléculas chave no direccionamento axonal foram identificadas em invertebrados e vertebrados, mas o papel da transcrição no controlo dos mecanismos de direccionamento axonal tem sido pouco estudado. Nesta dissertação efectuámos uma análise genómica global da regulação da transcrição em embriões de Drosophila, através da tecnologia de microarrays. Para o efeito usámos mutantes e transgénicos de direccionamento axonal, que se encontram bem caracterizados. Na tecnologia de microarrays da Affymetrix, algoritmos de Medidas de Expressão (ME) combinam os valores de várias sondas – correspondentes ao mesmo gene – num único valor. Neste trabalho avaliámos o desempenho de cinco MEs – MAS.5.0, dChip, RMA, PDNN e GCRMA – combinando análise estatística global com informação biol ógica conhecida. O uso de um estudo biológico – por oposição a um estudo de spike-in – permitiu avaliar as MEs em condições reais de preparação laboratorial. Os nossos resultados indicaram que RMA e PDNN são as ME mais equilibradas. MAS.5.0 é a ME menos fiável. dChip revela lacunas em algumas tarefas, enquanto que GCRMA apresenta falhas para valores de intensidade muito baixos. As experiências de microarrays produzem vastas quantidades de dados, sendo necessário algoritmos computacionais para analisar globalmente os resultados. Neste trabalho adaptámos o algoritmo de clustering HOPACH (Hierarchical Ordered Partitioning and Collapsing Hybrid), que combina as vantagens de algoritmos de partição e hierárquicos. A nossa adaptação de HOPACH identificou grupos pequenos e homogéneos, produzindo simultaneamente clusters grandes, de genes expressos de forma não diferencial. O nosso método elimina o passo de filtro, que reduz o número de genes interessantes. Caracterizámos os clusters resultantes de HOPACH relativamente à sua relevância no direccionamento axonal através de dois vocabulários controlados: Gene Ontology (GO) e as anotações anatómicas do Atlas of Pattern of Gene Expression (APoGE). Sugerimos vários genes candidatos para futuras experiências e provámos que a combinação de clustering com vocabulários controlados resultante da literatura e de padrões de expressão in situ é uma abordagem eficaz no estudo de redes de transcrição. O Cluster 49001 contém um número significativo de genes expressos em hemócitos – células sanguíneas da Drosophila. Observámos através de expressão de RNA que nos mutantes de slit e nos mutantes duplos de slit e robo a migração dos hemócitos não ocorre normalmente; surpreendentemente o duplo mutante para robo e robo2 – os receptores de slit – não apresenta o mesmo fenótipo para os hemócitos, o que sugere que a migração dos hemócitos poderá ocorrer através do envolvimento de slit, mas sem o envolvimento dos habituais receptores de slit. Há um conjunto de clusters enriquecido em ciclinas celulares, o que nos levou a examinar os padrões de expressão de RNA e proteína em mutantes e transgénicos de direccionamento axonal. Os resultados obtidos mostram que a sobre-expressão de robo é acompanhada por um aumento de RNA e proteína de várias ciclinas celulares; também observámos que as células que expressam ciclinas celulares estão anormalmente localizadas nos embriões de slit e robo12, encontrando-se afastadas da linha média. Estas duas observações sugerem um envolvimento, até ao momento desconhecido, das ciclinas celulares no direccionamento axonal. O resultado desta dissertação indica que a regulação da expressão genética tem um papel relevante no direccionamento axonal. Também encontrámos uma ligação entre direccionamento axonal e migração dos hemócitos, um resultado que está de acordo com resultados publicados recentemente [57] que indicam que moléculas de direccionamento axonal foram cooptadas durante a vascularização em vertebrados. Outra conclusão do nosso estudo aponta para a importância das ciclinas celulares no contexto do direccionamento axonal. Estes resultados ajudam a compreender melhor os mecanismos de regulação do direccionamento axonal in vivo. |
|---|
Atividades financiadas
Não foram encontrados projetos financiados.