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Ruxolitinib and pimozide as new therapeutic approaches in acute lymphoblastic leukemia

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Summary:	A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica heterogénea caracterizada pela progressiva acumulação de linfoblastos essencialmente na medula óssea e sangue periférico. Esta doença afeta, principalmente, crianças em cerca de 80% dos casos, e o auge da doença ocorre entre os 2 e os 5 anos de idade. Modificações genéticas que ocorrem nas células progenitoras da linhagem linfoide, provocam alterações no normal processo de diferenciação dos linfócitos, levando a que ocorra a proliferação anormal de células imaturas. De facto, a LLA é caracterizada por alterações cromossómicas e genéticas que definem grupos geneticamente distintos. A identificação destas alterações estruturais é de extrema importância, de modo a que seja feito um correto diagnóstico da doença, com vista à determinação do nível de risco e ao desenvolvimento de terapias dirigidas a estas alterações.A via de sinalização celular JAK-STAT está envolvida em diversos processos celulares que regulam não só a hematopoiese e a diferenciação linfoide, mas também a proliferação e a sobrevivência celular. Alterações que ocorrem nesta via e que provocam uma desregulação da mesma, estão envolvidas no desenvolvimento de diversas doenças hematológicas onde se inclui a LLA. A aberrante ativação da via é provocada por alterações genéticas em diversos componentes onde se incluem mutações nos genes que codificam as proteínas JAK2, STAT5 e calreticulina. Este comprometimento da via leva a que ocorra uma desregulação nos normais processos que regulam a proliferação e sobrevivência celular, levando a uma proliferação e sobrevivência descontroladas de células leucémicas. Deste modo, a via de sinalização JAK-STAT constitui um alvo terapêutico bastante atrativo para o desenvolvimento de novos fármacos neste tipo de leucemia.Este trabalho teve como principais objetivos a caracterização dos níveis de expressão do gene que codifica a calreticulina (CALR), assim bem como a identificação de possíveis mutações do mesmo gene nos 5 modelos de LLA. Adicionalmente, procurou-se avaliar o potencial terapêutico de dois fármacos inibidores da via JAK-STAT, o ruxolitinib (RUX) e o pimozide (PIM). Para este fim, foram utilizados 5 modelos de LLA, as linhas celulares 697 e REH que correspondem a células do tipo B, e as linhas CEM, JURKAT e MOLT4 que são células do tipo T. A avaliação dos níveis de expressão do CALR foi feita através de PCR quantitativo em tempo real, e a deteção de mutações por sequenciação de Sanger. Para avaliar o potencial terapêutico dos fármacos RUX e PIM na viabilidade celular, as linhas celulares utilizadas foram expostas a diversas concentrações destes inibidores em diferentes esquemas terapêuticos que incluíram a administração em toma única e diária, assim como a associação terapêutica entre os dois fármacos. Posteriormente, foram analisados os níveis de proliferação recorrendo ao ensaio da resazurina. A morte celular induzida pelos fármacos foi analisada através de citometria de fluxo, usando a dupla marcação da anexina-V e 7-AAD, e por microscopia óptica, através da análise morfológica com a solução de May-Grünwald-Giemsa. Por fim, o ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo, utilizando o marcador de ADN, o iodeto de propídio. Relativamente à expressão do gene CALR, as linhas celulares em estudo apresentaram níveis de expressão semelhantes, com a excepção da linha celular JURKAT onde foi detectada uma maior expressão deste gene. Adicionalmente, não foi detectada nenhuma mutação envolvendo o exão 9 do gene CALR nas linhas celulares testadas. O RUX demonstrou ter um efeito dependente do tempo de incubação, da linha celular e do esquema de administração. Este fármaco teve um efeito citotóxico nas linhas celulares em estudo, mediado pela activação da apoptose, porém não apresentou qualquer efeito citostático. Por outro lado, o PIM também demonstrou ter um efeito não só dependente da dose administrada e do tempo, mas também da linha celular e do esquema de administração nestes modelos de LLA. A apoptose foi o principal tipo de morte induzida pelo PIM nas linhas celulares, tendo sido confirmada através de citometria de fluxo e da análise dos aspetos morfológicos característicos da morte celular por apoptose, por microscopia ótica. Adicionalmente, o PIM teve um efeito citostático na linha celular JURKAT, induzindo um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. Para finalizar, a combinação dos dois fármacos, RUX e PIM, não teve qualquer efeito sinérgico nas linhas celulares.Concluindo, estes resultados sugerem que os inibidores da via JAK-STAT, RUX e PIM, podem constituir uma promissora abordagem terapêutica na leucemia linfoblástica aguda, onde a sua eficácia poderá estar associada às diferenças genéticas.
Main Authors:	Estevam, Alexandre Miguel Figueiras
Subject:	Leucemia linfoblástica aguda Via de sinalização JAK-STAT Calreticulina Ruxolitinib Pimozide Acute lymphoblastic leukemia JAK-STAT pathway Calreticulin Ruxolitinib Pimozide
Year:	2020
Country:	Portugal
Document type:	master thesis
Access type:	embargoed access
Associated institution:	Universidade de Coimbra
Language:	English
Origin:	Estudo Geral - Universidade de Coimbra