Glaucoma is the number one cause of irreversible vision loss worldwide. Death of retinal ganglion cells (RGC), which results in the progressive loss of visual function, occurs in glaucoma and other ocular diseases caused by hypoxia and ischemia. Although glaucoma is a multifactorial neurodegenerative disease, the only currently method of treatment involves reduction of intraocular pressure and, at the present, there is no effective treatment to prevent RGC apoptosis. Notably, it has been reported that erythropoietin (EPO), a cytokine hormone produced in response to hypoxia, has significant neuroprotective and neuroregenerative properties in several types of ocular disorders. Pre-clinical studies in glaucoma animal models involving EPO have yielded very promising results. All studies involving EPO ocular administrations have used systemic, intravitreal or retrobulbar administration to reach retinal desired EPO concentrations. However, EPO chronic systemic administration can lead to adverse side effects related with haematopoiesis stimulation, while intravitreal or retrobulbar administrations are invasive procedures that can induce several complications such as endophthalmitis, retinal detachment, vitreitis, retinitis, choroiditis or cataracts. This thesis aims to clarify if EPO’s neuroprotection could be achieved by a non-invasive and safe periocular administration route without adverse effects. Being so, this work evaluates the subconjunctival route as an alternative for EPO administration in glaucoma disease. After the first in vitro study, where the permeation of EPO across the periocular tissues was quantified, all work was developed in in vivo models. EPO’s ocular permeation after subconjunctival administration was tested, both in physiological and glaucomatous conditions. Furthermore, both retinal morphological and physiological effects of EPO administered by this route were assessed in glaucomatous animals. Results showed that EPO, when administered subconjunctivally, can permeate the main ocular barriers and reach RGC layers, in both physiological and glaucomatous conditions, without significant local or systemic side effects. More than showing that EPO can reach the retina by this route, results also concluded that subconjunctival EPO administration seems to have structural and functional beneficial effects on the retina after glaucoma induction in rats.

The present work investigates the effects of chitosan-hyaluronic acid-epoetin beta (CS/HA-EPOβ) nanoparticles after topical ocular administration in a rat glaucoma model. Wistar Hannover rats (n = 24) were submitted to a complete ophthalmological examination and electroretinography, followed by glaucoma induction in their right eye on day 1 of the study. Treatment group (T) received CS/HA-EPOβ nanocarriers (n = 12), while the control group (C) received only empty ones. Electroretinography was repeated on day 3 (n = 24) and before euthanasia on day 7 (n = 8), 14 (n = 8), and 21 (n = 8), followed by bilateral enucleation and histological assessment. The animals showed good tolerance to the nanoformulation. Maximum IOP values on the right eye occurred shortly after glaucoma induction (T = 62.6 ± 8.3 mmHg; C = 63.6 ± 7.9 mmHg). Animals from the treated group presented a tendency for faster recovery of retinal electrical activity (p > 0.05). EPOβ was detected on the retina of all treated eyes using immunofluorescence. Control animals presented with thinner retinas compared to the treated ones (p < 0.05). Therefore, topical ocular administration of CS/HA-EPOβ nanoparticles enabled EPOβ delivery to the retina of glaucomatous rats and promoted an earlier retinal recovery, confirming EPOβ’s neuroprotective effects. The encouraging results of this preclinical study pave the way for new strategies for topical ocular administration of neuroprotective compounds.

An increasing incidence of eye diseases has been registered in the last decades in developed countries due to the ageing of population, changes in lifestyle, environmental factors, and the presence of concomitant medical conditions. The increase of public awareness on ocular conditions leads to an early diagnosis and treatment, as well as an increased demand for more effective and minimally invasive solutions for the treatment of both the anterior and posterior segments of the eye. Despite being the most common route of ophthalmic drug administration, eye drops are associated with compliance issues, drug wastage by lacrimation, and low bioavailability due to the ocular barriers. In order to overcome these problems, the design of drug-eluting ophthalmic lenses constitutes a non-invasive and patient-friendly approach for the sustained drug delivery to the eye. Several examples of therapeutic contact lenses and intraocular lenses have been developed, by means of different strategies of drug loading, leading to promising results. This review aims to report the recent advances in the development of therapeutic ophthalmic lenses for the treatment and/or prophylaxis of eye pathologies (i.e., glaucoma, cataract, corneal diseases, or posterior segment diseases) and it gives an overview of the future perspectives and challenges in the field.

Glaucoma is a neurodegenerative disease, characterized by vison loss derived from the degeneration of the optic nerve and retinal ganglion cell (RGCs) death. Previous works have shown that neuroinflammation speared by microglia is major part in the pathology. Also, published work from our group has shown that cytotoxic factors involved in the death of retinal cells have originated from microglia exposed to an elevated hydrostatic model. Not only that, but it has been shown that controlling microglia reactivity showed a positive impact on the RGCs both in vitro and in vivo.However, the sensor for this pressure changes has yet to be identified. Piezo1, an ion channel sensitive to mechanical stimuli, is responsible for the detection of various types of pressure changes, such as sheer stress and stretching. It has been shown to be expressed in the microglia and to be involved in inflammation, yet the study of this channel in the retina remains to be addressed. So, we aimed to investigate the role of Piezo1 in microglia-induced neuroinflammation in glaucoma. BV-2 cells were exposed to elevated hydrostatic pressure for 4 or 24 hours in the presence or absence of 1µM of GsMTx-4, a mechanosensor inhibitor. Also, the cells were exposed to 10µM of Yoda-1, a Piezo1 selective agonist also in the presence or absence of GsMTx-4. This work was divided in two main tasks. The first task’s role was to understand the role of Piezo1 in elevated pressure induced microglia reactivity, and it was divided in two main paths: assessing ROS production using DHE, MitoSox Red and DCF, probes designed for various ROS and cell proliferation was analysed using Click-iT EdU reaction. The second task consisted in understanding the role of Piezo1 in phenotype transition of microglia and for that we used a fluorescence probe, DQ-Ovalbumin, to evaluate antigen processing. Overall, the results of ROS production show no statistical differences, only apparent trends, such as the decrease of ROS production when GsMTx-4 is used in tandem with the stimuli. The cells appear to show a significant decrease of proliferation when Yoda-1 is used for 24 hours, fact that it is not derived from possible cell death or metabolic problems, otherwise all the other experimental conditions show no statistical changes. BV-2 cell’s antigen processing seems to not be affected in the overall, showcasing no significant changes, however, the exposure of these cells to EHP for 24 hours seem to indicate a trend.This work showed that despite the overall lack of significant changes, some trends are shown, and more work is needed to explore them. In the end, this work leaves many doors open for future research and a better understanding of Piezo1 and microglia-induced neuroinflammation

O glaucoma é uma das principais causas de cegueira em todo o mundo, e a pressão intraocular elevada desempenha um papel crucial no início e progressão da doença. Esta doença neurodegenerativa é caracterizada pela perda de células ganglionares da retina e dano no nervo ótico. Estudos anteriores demonstraram que o controlo da neuroinflamação mediada pelas células da microglia é suficiente para prevenir a morte das células ganglionares da retina. Também foi descrito, pelo nosso grupo, que as células da microglia libertam fatores citotóxicos em condições de pressão elevada, levando à morte das células da retina. No entanto, a forma como as células da microglia detetam aumentos de pressão ainda não está completamente esclarecida.O Piezo1 é um canal iónico mecanossensível que deteta alterações de pressão e tem sido relacionado com várias doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer e Parkinson. O Piezo1 é expresso nas células da microglia e na retina, no entanto, o seu papel no glaucoma, especialmente nas células da microglia da retina em condições de pressão elevada, ainda não está claro. Assim, neste trabalho, pretendemos estudar o papel do Piezo1 na neuroinflamação mediada pelas células da microglia, bem como na retina.Neste estudo, as células BV-2, uma linha celular de microglia, foram incubadas com Yoda1 (agonista do Piezo1) e GsMTx4 (inibidor do Piezo1). As células foram expostas a pressão hidrostática elevada, como um modelo in vitro de glaucoma. As experiências de imunocitoquímica para Piezo1 e a imagiologia de cálcio de célula única foram realizadas para estudar a presença e função do Piezo1. O papel do Piezo1 na migração das células da microglia, na produção e libertação de ATP e no ambiente inflamatório também foi avaliado. Murganhos C57BL/6J foram injetados no vítreo com Yoda1 e o papel do Piezo1 na reatividade glial e morte celular da retina foi avaliado em criossecções de retina 24 horas e 7 dias após a injeção.O nosso trabalho mostrou que o Piezo1 está presente e funcional nas células BV-2. A ativação do Piezo1 desencadeia influxo de cálcio, modula o ambiente inflamatório e afeta a migração celular, sugerindo um papel do Piezo1 na reatividade das células da microglia. Na retina, a ativação do Piezo1 desencadeou reatividade glial e recrutamento da microglia. Notavelmente, embora um aumento da morte celular tenha sido observado 24 h após a injeção de Yoda1, este efeito diminuiu após sete dias, provavelmente devido à eliminação das células mortas pelas células da microglia ou a respostas adaptativas na retina.Em conclusão, mostrámos que o Piezo1 desempenha um papel multifacetado tanto na reatividade das células da microglia como na retina, embora os seus efeitos pareçam ser dependentes do contexto.

A deficiência visual devido a doenças oftalmológicas tem um impacto negativo na qualidade de vida dos doentes. O glaucoma, sendo considerada a primeira causa de cegueira irreversível não é exceção. Sabe-se que a avaliação clínica do doente é imprescindível, no entanto ela não permite avaliar qual o impacto que o glaucoma tem no quotidiano, sendo essencial possuir instrumentos de medição fiáveis e validados para avaliar a qualidade de vida dos doentes.O objetivo desta dissertação consiste não só na adaptação cultural e linguística do instrumento de medição específico para o glaucoma –Questionnaire Qualité de Viet et Glaucome (Glau-Qol17) para a população portuguesa, como também na determinação das suas propriedades psicométricas. Este questionário é composto por 17 itens e é uma versão reduzida do Glau-Qol36. Os itens estão distribuídos por 7 dimensões: ansiedade, imagem de si, estado psicológico, vida quotidiana, condução, limitações e controlo da situação.Inicialmente procedeu-se à adaptação cultural, que consistiu em diversas fases, nomeadamente: tradução inicial, síntese das traduções, retro-tradução, revisão pelos especialistas e pré-teste. Posteriormente, a fim de determinar as suas propriedades psicométricas, o Glau-QoL17 foi aplicado, juntamente com um instrumento de medição específico para a visão (VFQ-25) e um instrumento genérico (EQ-5D), a 210 indivíduos com diferentes níveis de severidade de glaucoma inseridos na consulta externa do Centro Hospitalar Baixo Vouga. A fiabilidade do Glau-Qol17 foi garantida através da coerência interna e da reprodutibilidade. A coerência interna foi determinada através do alfa de Cronbach e variou de 0,490 a 0,844 e a reprodutibilidade teste re-teste foi avaliada pelo coeficiente de correlação intraclasse (ICC), que variou de 0,527 a 0,907. No que concerne à validade, foi estabelecida a validade de conteúdo, de construção e de critério. Com esta dissertação, concluímos que o Glau-Qol17 é um instrumento de medição específico para o glaucoma considerado fiável, válido e que permite distinguir os diferentes níveis de severidade no glaucoma.

O glaucoma é uma doença crónica e assintomática que afeta cerca de 60 milhões de pessoas em todo o mundo. A administração incorreta das gotas e a deteção tardia da doença pode, muitas vezes, tornar irreversível a perda de visão.De forma a colmatar este problema, foi desenvolvido um inserto ocular, registado como ineye®, que permite a libertação de um ou mais fármacos de forma controlada durante um tempo determinado. Este inserto deve possuir algumas características, tais como, ser insolúvel, biocompatível e confortável para o paciente.Ao longo deste trabalho pretende-se otimizar essa libertação, tendo sido testadas várias formulações de copolímeros de PCL/PEG e que, ao mesmo tempo, respeitem os requisitos necessários para a libertação simultânea de dois fármacos: cloridrato de dorzolamida e maleato de timolol.Numa fase inicial utilizaram-se insertos com formulações de PCL/PEG distintas para libertar, em separado, cada um dos fármacos. Numa segunda fase, a partir desses resultados, selecionou-se o polímero mais promissor para libertar os dois fármacos em simultâneo. Estes estudos de cinética de libertação foram realizados in vitro em água ultrapura e pretende-se que haja uma libertação linear de cada um dos fármacos, ao longo do tempo.Para além destes testes, analisou-se a capacidade de absorção de água e perda de massa para os diferentes insertos, bem como a sua estrutura química, através de Ressonância Magnética Nuclear. Relativamente aos fármacos, foi necessário analisar a sua estabilidade a 37ºC e se adsorvem ao polímero utilizado.Os resultados obtidos permitiram obter um maior conhecimento, nomeadamente na estratégia de imobilização de fármacos e de que forma seria possível melhorar, ainda mais, a sua libertação.

Glaucoma is a leading cause of irreversible blindness that is characterized by optic nerve damage and retinal ganglion cell (RGC) death. Elevated intraocular pressure (IOP) is an important risk factor in glaucoma and the only that is modifable. Indeed, current treatments are directed towards IOP lowering, however many patients continue to lose vision despite successful IOP control. Therefore, new and more effective treatments are necessary, and targeting neuroprotection of RGCs is considered to be an additional therapy. RGCs express adenosine A3 receptor (A3R) and its activation confers protection to RGCs following an excitotoxic stimulus, as occurs in glaucoma. These fndings strongly support that A3R activation can protect RGCs from glaucomatous damage. Therefore, we aimed to study the protective properties of A3R agonist against glaucomatous insult (Chapter 2). Ocular hypertension (OHT) was induced by laser photocoagulation of the limbal veins and A3R agonist (2-Cl-IB-MECA, 5 µl, 1.2 µM) was delivered intravitreally immediately after the induction of OHT. The outcome was assessed 7 days post injection. The treatment with A3R agonist increased RGC survival and attenuated the impairment in retrograde axonal transport induced by OHT, which is consistent with the preservation of the optic nerve structure. These benefcial effects of A3R activation may be contributing to the maintenance of the RGC function in OHT animals. Therefore, A3R can be suggested as a good therapeutic target to protect RGCs from glaucomatous damage. Drug delivery into the posterior part of the eye is mainly achieved by intravitreal injection. However, frequent intravitreal injections can lead to retinal detachment, cataract, and endophthalmitis. Therefore, the design of sustained drug delivery systems for the posterior segment of the eye can encompass a therapeutic breakthrough. The development of these systems has been a challenge for many years, but it is nowadays used in clinical practice for some retinal diseases. Biodegradable implants present an additional advantage since they are degraded into nontoxic products and, then safely eliminated, contrary to nonbiodegradable implants. Aiming to overcome the need of multiple intravitreal injections, herein a new biodegradable intraocular implant (porous poly(Ɛ-caprolactone) (PCL)-based intraocular implants) was developed for controlled drug release in collaboration with the Chemical Engineering Department of the Faculty of Sciences and Technology of the University of Coimbra (Chapter 3, supplementary information). Thus, the potential of PCL-based implants to be used as intraocular drug delivery device was assessed (Chapter 3). The presence of the PCL implant or the degradation products did not cause neuronal cell death, particularly did not affect the number of RGCs, in retinal primary neural cell cultures and retinal organotypic cultures, reinforcing the possibility of testing these implants in animal models. The PCL-based implants were surgically introduced in the vitreous of Wistar rats, and the outcome was evaluated at 4 and 8 weeks after the surgery. The presence of the PCL implant or the procedure did not change retinal function (evaluated by electroretinography, ERG) nor retinal structure (evaluated by optical coherence tomography, OCT). Moreover, PCL implant did not induce alterations in retinal neurons and had no toxic effect in RGCs in vivo, since the number of RGCs was not altered. The impact to retinal glial cells was assessed, and both the procedure and the presence of PCL implant may induce Müller cell gliosis, without affecting microglial cells and astrocytes. The assessment of retinal structure18 and Müller cell reactivity 1 year after surgery demonstrated that the structure was not altered and that Müller cell gliosis observed in early time points was a transient effect. Taking into consideration the lack of retinal toxicity of PCL implants, this new device can now be loaded with drugs to tackle retinal diseases. Indeed, since the activation of A3R confers protection to the retina, in particular to RGCs, implants loaded with 2-Cl-IB-MECA can be hypothesized as a new strategy to protect the retina from degeneration (Chapter 4). 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants were developed in collaboration with the Chemical Engineering Department of the Faculty of Sciences and Technology of the University of Coimbra (Chapter 4, supplementary information). The PCL implant loaded with 2-Cl-IB-MECA presented an extended drug release of around 30 days. Then, the drug released from the implant maintained functional activity, as determined in vitro by single-cell Ca2+ imaging of RGCs. 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants were immersed in a saline solution for 24 h that was able to reduce the glutamateevoked increase in intracellular Ca2+ concentration in immunopurifed RGC cultures. Drug-free and 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants were introduced in the vitreous after inducing transient retinal ischemia, and the outcome was assessed 1 month after lesion induction. The presence of 2-Cl-IB-MECA-loaded PCL implants in the vitreous preserved the structure of the optic nerve and preserved the anterograde axonal transport. Moreover, the survival of RGCs was increased and the function of RGCs was maintained upon transient retinal ischemia, indicating that RGCs are protected from ischemia-reperfusion damage. These results suggest that A3R represents a potential drug target for the development of novel therapeutic strategies for glaucoma. Moreover, the incorporation of 2-Cl-IB-MECA in a biodegradable intraocular implant may be a promising therapeutic strategy for glaucoma.

O glaucoma é das principais causas de cegueira a nível mundial. Esta doença é caracterizada pela atrofia do nervo ótico e morte de células ganglionares da retina (CGR). A pressão intraocular (PIO) elevada é o principal fator de risco para o desenvolvimento e progressão desta doença. A neuroinflamação mediada pelas células da glia contribui para a neurodegeneração da retina no glaucoma. No entanto, os mecanismos que estão envolvidos neste processo ainda não foram clarificados. As microvesículas (MVs) são vesículas extracelulares (VE) formadas pela fissão para o exterior da membrana plasmática e estão envolvidas na comunicação celular. A contribuição das MVs derivadas de microglias para a inflamação da retina é desconhecida. Tendo em conta o envolvimento das células da microglia e das células de Müller no glaucoma, neste estudo, pretendeu-se investigar se as MVs derivadas das células da microglia interferem com as células de Müller e avaliar os efeitos das MVs nas células de Müller e na retina.As células da microglia (linha celular BV-2) foram expostas a pressão hidrostática elevada (PHE), mimetizando o aumento da PIO. As células da condição controlo foram incubadas a pressão atmosférica. As MVs provenientes de células BV-2 (MV-CT e MV-PHE) foram isoladas por ultracentrifugação de baixa velocidade e caracterizadas por análise de rastreamento de nanopartículas, microscopia eletrónica de transmissão e expressão de marcadores proteicos característicos de VE. As células de Müller (linha celular MIO-M1) foram incubadas com MV-CT ou MV-PHE e expostas a PHE ou pressão atmosférica. Em seguida, os efeitos da PHE e das MVs foram avaliados nas células MIO-M1. Para além disso, MVs foram injetadas no vítreo de murganhos C57BL/6J e os efeitos foram avaliados 24h e 7 dias após a injeção.As células MIO-M1 expostas a PHE e incubadas com MVs não apresentaram alterações que indiquem gliose. As células MIO-M1 sob PHE aumentaram a produção de fatores pró-inflamatórios e a expressão de quimiocinas, no entanto, as MVs derivadas de microglias induziram, de uma forma geral, a resposta oposta nas células MIO-M1. As células MIO-M1 têm uma resposta moderada à PHE e as MVs de microglias são capazes de influenciar a resposta das células de Müller, no entanto, são necessários mais estudos para explorar aprofundadamente estes efeitos.Após a administração intravítrea das MVs nos murganhos C57BL/6J, a análise por tomografia de coerência ótica mostrou que as MVs não alteraram significativamente a espessura da retina e observaram-se “spots” no vítreo, sugerindo a presença de células no vítreo, provavelmente células pertencentes ao sistema imunitário. A análise dos infiltrados vítreos revelou que estas células se encontram mais presentes 24h após a injeção de MV-PHE, comparando com o efeito das MV-CT. Sete dias após a injeção, ocorreu um decréscimo substancial na presença destas células no vítreo de animais em que MV-PHE foram administradas em comparação com a injeção de MV-CT. Os níveis das proteínas TSPO e iNOS aumentaram 24h após a exposição de MVs, sugerindo um aumento da inflamação. Imunohistoquímica revelou um aumento na imunomarcação de GFAP e no número de células MHC-II+/Iba1+, o que indica ativação das células de Müller e da microglia após a injeção de MVs. Além disso, as MVs induziram a morte de células da retina e a perda de CGR. De modo geral, as MVs derivadas de microglias induziram neuroinflamação da retina, gliose reativa e perda de CGR, mostrando que as MVs de origem microglial podem contribuir para a degeneração da retina. Curiosamente, ambas as populações de MVs causaram efeitos na retina, o que indica que estas conseguem disseminar o sinal inflamatório independentemente do estado de ativação das microglias. Em resumo, os resultados demonstraram que as microglias libertam MVs capazes de interagir com células de Müller e células da retina, modulando a sua resposta, o que segure que as MVs derivadas de microglias podem ser uma via de comunicação entre células gliais e propagar sinais inflamatórios na retina.

The visual impairment that often leads to blindness causes a higher morbidity rate. The goal of this work is to create a novel biodegradable polymeric implant obtained from coaxial fibers containing the dispersed drug-acetazolamide-in order to achieve sustained drug release and increase patient compliance, which is of the highest importance. Firstly, during this work, uncoated implants were produced by electrospinning, and rolled in the shape of small cylinders that were composed of uniaxial and coaxial fibers with immobilized drug inside. The fibers were composed by PCL (poly ε-caprolactone) and Lutrol F127 (poly (oxyethylene-b-oxypropylene-b-oxyethylene)). The prepared implants exhibited a fast rate of drug release, which led to the preparation of new implants incorporating the same formulation but with an additional coating film prepared by solvent casting and comprising PCL and Lutrol F127 or PCL and Luwax EVA 3 ((poly (ethylene-co-vinyl acetate)). Implants were characterized and in vitro release profiles of acetazolamide were obtained in phosphate buffered saline (PBS) at 37 °C. The release profile of the acetazolamide from coated implant containing Luwax EVA 3 is considerably slower than what was observed in case of coated implants containing Lutrol F127, allowing a sustained release and an innovation relatively to other ocular drug delivery systems.