Reconhece-se actualmente que o vinho tem propriedades benéficas no organismo humano, sendo constituído por compostos que exercem uma influência positiva no metabolismo dos indivíduos que o consomem com regularidade e moderação. O resveratrol (trans-3,4’,5-trihidroxiestilbeno) é uma fitoalexina que está presente em diversos alimentos e bebidas, em particular no vinho tinto. Das várias classes de polifenóis existentes no vinho, o resveratrol (estilbeno) é um dos compostos mais estudados do ponto de vista de importância biológica, devido aos potenciais efeitos benéficos para a saúde humana. Na primeira parte deste trabalho foi desenvolvido e validado um método analítico sensível, com vista a determinar, quantitativamente, as concentrações de resveratrol em amostras de vinhos tintos portugueses, utilizando a extracção em fase sólida (SPE) e a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um detector de díodos (HPLC-DAD). Na segunda parte, foram implementadas técnicas, tais como, o método de difusão em disco e o método da microdiluição, que permitiram avaliar a actividade antimicrobiana do resveratrol em diversos microrganismos, nomeadamente bactérias Gram-positivas (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis) e Gram-negativas (Escherichia coli, Klebsiella pnemoniae, Salmonella typhimurium e Pseudomonas aeruginosa). O efeito do resveratrol em bactérias Gram-positivas foi também analisado, recorrendo-se às curvas de morte, de forma a tentar assim compreender se o resveratrol actua como um agente bactericida ou bacteriostático. Analisou-se, ainda, a acção do resveratrol em Bacillus cereus, recorrendo à microscopia e à citometria de fluxo, de forma a tentar compreender o mecanismo de acção deste composto. Finalmente, foi também avaliada a actividade antimicrobiana do resveratrol em diferentes estirpes de Helicobacter pylori, utilizando o método da difusão em disco e o método da diluição em agar. Para além disso, verificou-se a hipótese do resveratrol e amostras de vinho tinto (devidamente quantificadas na primeira parte deste trabalho) inibirem a actividade da urease de H. pylori, considerada um dos principais factores de virulência deste microrganismo. Complementou-se, ainda, o estudo analisando cineticamente a actividade da urease na presença do resveratrol. O método analítico foi validado de acordo com normas internacionalmente aceites quanto a: especificidade, linearidade, limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ), precisão, exactidão, estabilidade e eficiência de extracção. Verificou-se ainda a aplicabilidade do método, analisando 186 amostras de vinhos tintos comerciais, provenientes de diferentes regiões, castas e anos. Os resultados obtidos demonstraram que os níveis de trans-resveratrol nos vinhos tintos, variaram entre 0,05 e 10,9 μg/mL, enquanto que as concentração de cis-resveratrol variaram entre 0,04 e 8,71 μg/mL. No que diz respeito à actividade antimicrobiana do resveratrol, verificou-se que este composto possui actividade contra todas as bactérias Gram-positivas em estudo. Os resultados demonstraram que o resveratrol tem um efeito bacteriostático que afecta o crescimento da célula bacteriana em todas as estirpes testadas. Quanto ao mecanismo de acção do resveratrol, os resultados obtidos sugerem que o crescimento celular do Bacillus cereus foi inibido, o que por sua vez terá levado à paragem da divisão celular. Na última parte deste trabalho, confirmou-se a actividade antibacteriana do resveratrol em diferentes estirpes de Helicobacter pylori. Para além disso, quer o resveratrol, quer os vinhos tintos analisados demonstraram um efeito inibitório na actividade da urease de Helicobacter pylori. A análise cinética revelou que o resveratrol é um inibidor da urease não competitivo e reversível. O presente trabalho contribuiu por um lado, para o melhor conhecimento do teor de resveratrol nos vinhos portugueses, e por outro demonstrou o potencial do resveratrol como agente antibacteriano, podendo no futuro ter potenciais aplicações tanto na conservação dos alimentos como na terapia clínica.

The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM). The main route of contamination is the inhalation of fungal propagules that convert to yeast in the host tissues. The urease is among the factors of virulence described for dimorphic fungus. It hydrolyzes the urea producing molecules of ammonia and carbamate. Pbure has 3,012 bp, corresponding to a predicted protein of 837 amino acids, predicted molecular mass of 90 kDa and pI 6.0. PbURE has signature to nickel-dependent enzyme for its activity. The phylogenetic relationship between PbURE and urease from other fungi was evaluated. The cDNA that encodes PbURE was inserted into the expression vector pET-32a and recombinant protein of 103 kDa was expressed. Polyclonal antibody were produced against PbUREr and used on Western blot, Far-Western blot and ELISA. The results showed that PbUREr interferes on interaction between P. brasiliensis and pulmonary epithelial cells A549. PbUREr was able to bind to proteins fibronectin and type IV collagen, components of the extracellular matrix (ECM). The interaction between PbURE and calnexin protein was identified by the technique of two-hybrid.

Helicobacter pylori is a bacteria living in the stomach and it’s associated with several diseases in the gastrointestinal system. The survival and replication of H. pylori is related to the enzymatic activity of urease, which allow the resistance of bacteria to gastric acidity. Antimicrobial drugs are used against H. pylori, but there are occurrence of antibiotic resistance. In the view of the need for new antibacterial agents, this study aimed to investigate new compounds, of natural and synthetic source against urease. In vitro screening of compounds and Natural Products (NPs) was performed using the spectrophotometric method by measuring the reaction product (indophenol blue) at λ = 600 nm. The enzyme kinetics study of urease (Canavalia gladiata) (UJB) was performed for assay standard and the Km, Vmax and Kcat data (4.25 ± 0.62 mmol/L, 44.34 ± 1.33 mmol/L/min and 2062.3 s-1, respectively) were found similar to literature. Among the 37 chalcones assessed, nine showed significant inhibition (1a, 1c, 1g, 1h, 2a, 2b, 2c, 2d and 2m) with inhibitory potency ranging between IC50 = 5.7 and 18.8 µmol/L. The inhibition mechanism was determined for the most potent compounds by in vitro and in silico assays, which chalcones 1h (Ki = 2.98 µmol/L), 2a (Ki = 6.19 µmol/L), 2c (Ki = 1.87 µmol/L), and 2m (Ki = 3.13 µmol/L) showed competitive behavior and 1c non-competitive (Ki = 17.3 µmol/L). Chalcones 2c and 2m revealed the best MIC values (250 and 128 µg/mL, respectively) anti-H. pylori in vitro. Among NPs evaluated, five compounds from the fungus Fusarium proliferatum (5a-5e) were also inhibitors of UJB, which compounds 5a and 5b showed lower IC50 values with competitive behavior on urease (Ki of 0.55 and 1.1 µmol/L). Crystals obtained from the active extract of Pholiota nameko mushroom were analysed by 1D and 2D NMR experiments, and the compound was characterized as mannitol, which showed an IC50 value of 35.5 µmol/L on UJB. The inhibitory enzymatic activity by mannitol could be a clue for the gastroprotective action and anti-H. pylori potential found in previous work. By in silico screening, the pharmacokinetic properties of all compounds were investigated using Lipinski's Rule of Five (RO5) as the main parameter. In addition to bioavailability study of these compounds, it was possible to use the obtained results to understand better the chalcones behavior (2c and 2m) revealed on H. pylori in vitro assay. By using in vitro and in silico tests it was possible to find new and promising UJB inhibitors.

The Paracoccidioides genus is composed of thermodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic human systemic mycosis in Latin America. These organisms grow as mycelium in temperatures below 28 °C and as yeast form in temperatures above 37 °C. Nitrogen is an important element in this microorganism’s nutrition that participates in the synthesis of proteins, nucleic acids and others biomolecules. In this regard, nitrogen uptake and metabolism are essential to growth and fungal establishment. When nitrogen levels and sources such as glutamine and ammonia concentration are limited, pathogenic fungus use a regulation system called Nitrogen Catabolic Repression that induces the expression of genes encoding permeases and enzymes required for the catabolism of secondary nitrogen sources, such as formamidase, gamma-glutamiltranspeptidase and urease. Gamma-glutamiltranspeptidase is an enzyme that catalyzes the first reaction of glutationa degradation and it has been the target of several studies about nitrogen starvation in various fungi. It has been observed that the expression of the gene encoding this enzyme was induced in limiting conditions of nitrogen and was repressed when the availability of nitrogen was high. Urease is an enzyme that catalyzes the degradation of urea in ammonia and carbonic acid. This enzyme is already known as a virulence factor in fungi such as Cryptococcus. neoformans, and also has been the target of studies about nitrogen starvation. In this study we expressed gamma-GT and urease proteins from Paracoccidioides brasiliensis, isolate Pb18, in Escherichia coli. The gene coding for Ggt and Ure were cloned in pET32a expression vector, and used for E. coli pLysS transformation. The recombinant proteins produced were shown to be catalytically active. Together, data obtained in this work could add knowledge about the role of gamma-GT and urease and can be used as a foundation for complementary experiments regarding nitrogen metabolism regulation, as well as in Paracoccidioides spp pathogenesis.

A urease de Helicobacter pylori (HP) é um fator de virulência que permite a colonização e sobrevivência desta bactéria na mucosa gástrica do estomago, podendo levar ao desenvolvimento da úlcera gástrica e do adenocarcinoma. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a urease de HP (HPU) tem ação pró-inflamatória em neutrófilos humanos. Entretanto o envolvimento direto da HPU sobre os efeitos vasculares ainda é pouco compreendido. Nosso trabalho tem como objetivo investigar os efeitos da HPU sobre células endoteliais e as possíveis vias de sinalização envolvidas nestes processos. O tratamento com a HPU (10 nM) durante 24hs não afetou a viabilidade das células endoteliais. Entretanto, observamos que a HPU foi capaz de induzir o aumento da permeabilidade e reduziu a resistência transendotelial. Corroborando estes dados, observamos que a HPU induziu a dispersão e a fosforilação de VE-caderina. Além disso, a HPU induziu o rearranjo do citoesqueleto de actina e a fosforilação da FAK. Em nosso estudo observamos também que a HPU induziu o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e oxido nítrico (NO ), e estes efeitos foram inibidos após o pré-tratamento das células HMEC1 com LY294002, inibidor da via PI3K-AKT. A produção de ROS induzida pela HPU promoveu o aumento da atividade do fator nuclear κB (NF-κB). Além disso, a HPU também foi capaz de induzir a adesão de neutrófilos a células endoteliais, assim como a tubulogênese. Os efeitos da HPU sobre as células endoteliais são modulados por integrinas, já que estes efeitos foram inibidos quando as células foram pré-tratadas com o RGD, antagonista geral de integrinas. Nossos dados mostram que a HPU ativa células endoteliais, possivelmente, via sinalização regulada por integrinas, exercendo um efeito pró-inflamatório e pró-angiogênico,e tendo um papel fundamental na patogênese causada por H.pylori.

A urease de Canavalia ensiformis (Jack bean urease, JBU) tem sido caracterizada por possuir ação entomotóxica. Apesar de vários trabalhos já terem sido realizados objetivando o estudo desse composto em diferentes modelos de insetos, poucos, ou nenhum, demonstrou o exato mecanismo de ação desse composto sobre o sistema nervoso desses animais. Nesse trabalho foi usado o modelo experimental de baratas da espécie Nauphoeta cinerea para se investigar os mecanismos centrais e periféricos induzidos pela JBU. Foram feitos ensaios de letalidade, bem como análises bioquímicas para a determinação da atividade sobre a aceticolinesterase do cérebro do inseto. Foram usados modelos biológicos in situ e in vivo com o intuito de se determinar a sensibilidade de diferentes sistemas fisiológicos ao composto. Como bioensaios foram usados a técnica de coração semi-isolado, de nervo-músculo coxal-abdutor metatorácico in vivo e da medida da atividade de grooming. Os ensaios para a determinação da dose letal mínima demonstraram que a JBU (1.5, 3 e 6μg/g de animal) não é letal para a barata N. cinerea. Esse fato pode ser explicado pela ausência de enzimas do tipo catepsinas no sistema digestivo de N. cinerea, ou pelo fato de termos administrado a urease pela via circulatória do animal. Os ensaios para a medida da atividade da AChE, nas mesmas doses, demonstraram que a JBU inibe significativamente essa enzima (20±2%, 65±2% e 75±3%).Na avaliação dos efeitos da JBU sobre a frequência cardíaca de barata, a uréase (1.5, 3 e 6μg/g de animal) induziu um efeito cronotrópico positivo que foi de 94±5bat./min no grupo controle salina, e 125±3bat./min com a administração da JBU (3μg/g de animal). Nessa série de experimentos, a adição de neostigmina (5μM) mimetizou o efeito cronotrópico positivo da urease o qual também foi inibido pela atropina (1μM).A obtenção dos registros da força de contração muscular em animais tratados com a JBU (1.5, 3 e 6μg/g de animal) demonstrou que a urease induz bloqueio neuromuscular irreversível que foi de (30±10%, 15±4% e 70±7%) respectivamente. Nessa série de experimentos, a administração de acetilcolina (50μg/g de animal) ou hidroxilamina (1μg/g de animal) mimetizou o efeito da urease na junção neuromuscular, sugerindo o envolvimento do neurotransmissor ACh na modulação dos efeitos sobre o sistema nervoso periférico da barata. O tratamento prévio dos animais com dexametasona (40μg/g de animal) inibiu parcialmente o efeito 9 bloqueador neuromuscular da JBU (~75%) sugerindo que parte do efeito da urease sobre a junção neuromuscular seja modulada por compostos pró-inflamatórios. Também foi evidenciado que o bloqueio dos receptores gabaérgicos pela bicuculina (5μg/g de animal), previne o bloqueio neuromuscular induzido pela JBU (~50%), sugerindo que a inibição da neurotransmissão periférica pela urease seja modulada pelo neurotransmissor GABA. A análise do comportamento de grooming, que é caracterizado pela limpeza das pernas e antenas, demonstrou que o valor controle para esse ensaio foi de (153±8s/30min de perna e 70±6s/30min de antena) e que a urease (1.5, 3 e 6μg/g de animal), induz um aumento significativo na frequência dos eventos de perna (177±23s/30min, 253±33s/30min e 363±23s/30min), mas não do de antena. Nesses ensaios a incubação do animal com octopamina (15μg/g de animal) mimetizou o efeito da urease, sugerindo uma atividade relacionada a esse neurotransmissor. O tratamento prévio dos animais com fentolamina (0.1μg/g de animal) impediu o aumento da taxa de grooming de perna pela urease, sugerindo que a mesma esteja atuando no receptor de octopamina. Os resultados reforçam o potencial das ureases como agentes inseticidas naturais demonstrando a complexidade dos mecanismos envolvidos na atividade neurotóxica desses compostos em baratas. Além disso, a atividade anticolinesterásica da urease de C. ensiformis não é suficiente para produzir a morte dos animais, como ocorre com os inseticidas químicos organofosforados. No entanto o efeito anticolinesterásico deve contribuir para o desenvolvimento das alterações comportamentais observadas.

A presente monografia foi elaborada com o intuito de rever os conhecimentos sobre a bactéria Helicobacter pylori de uma forma geral, realçando as principais estratégias que têm sido aplicadas no desenvolvimento de uma vacina capaz de a erradicar. O adenocarcinoma gástrico é a terceira principal causa de morte provocado por cancro a nível mundial, com maior incidência nos países em vias de desenvolvimento. A maioria destes cancros estão associados à infeção por H. pylori. Este microrganismo origina uma resposta imune muito intensa por parte do hospedeiro, recorrendo ao seu mecanismo fisiopatológico, desencadeando uma série de patologias gástricas, sendo a mais grave o cancro. O tratamento recomendado atualmente compreende o uso de terapêutica combinada de vários antibióticos com inibidores da bomba de protões. Todavia, uma vez que inúmeros doentes submetidos à terapêutica, não demonstram sucesso no combate à doença, este é considerado um tratamento de difícil execução. Assim, torna-se de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina capaz de erradicar esta bactéria, constituindo assim uma ferramenta poderosa na prevenção do cancro gástrico. Com base nesta necessidade, várias iniciativas de desenvolvimento de vacinas vão surgindo, focando-se na descoberta de antigénios e adjuvantes capazes de induzir uma resposta imunitária mais potente, bem como da via de administração mais adequada. Estes estudos mostram que a vacina pode ser profilática, e usada como terapêutica após infeção. Apesar dos inúmeros ensaios clínicos que têm sido desenvolvidos, não existe no mercado nenhuma vacina aprovada. Contudo, uma vacina promissora chegou à fase III dos ensaios clínicos. No entanto, foi descontinuada posteriormente, tornando-se assim a abordagem mais próxima de chegar ao mercado. Apesar de ser uma patologia de alcance global, o desenvolvimento de uma vacina contra H. pylori tem sido efetuado até agora por pequenos laboratórios, mostrando a necessidade de um grande investimento por parte das principais empresas farmacêuticas, com o objetivo de possibilitar a realização de ensaios clínicos mais satisfatórios e conclusivos.

A mineralização de compostos orgânicos da cama de frango acarreta perda de N via volatilização de NH 3 e, consequentemente, reduz o valor deste resíduo para seu aproveitamento como fertilizante. Uma alternativa para minorar essa perda é tratar a cama com aditivos químicos que desfavoreçam os processos associados à decomposição do N. O objetivo da Tese foi compreender como os aditivos químicos aumentam a retenção de N na cama de frango e as implicações que a utilização desse material como fertilizante traz para o solo e para a planta. A Tese foi dividida em três capítulos. No primeiro capítulo foram selecionados aditivos químicos e doses de aplicação com base no potencial de retenção de N e, posteriormente, avaliado o efeito dos produtos em ambiente de produção comercial. Em experimento de incubação laboratorial, combinando cinco aditivos [Al 2 (SO 4 ) 3 , fosfogesso, CuSO 4 , FeSO 4 e ZnSO 4 ] e três doses, verificou-se que a acidificação é proporcional a quantidade de aditivo aplicada e que as maiores doses diminuíram a perda de NH 3 nas camas tratadas com CuSO 4 e FeSO 4 , enquanto aumentou naquela tratada com fosfogesso. Em ambiente de produção comercial, dois experimentos (1 – cama nova de maravalha e 2 - cama de frango reutilizada) foram montados conforme delineamento em blocos casualisados sob esquema fatorial 4 x 2 + 1 e dez repetições, onde se combinaram a aplicação de Al 2 (SO 4 ) 3 , CuSO 4 , FeSO 4 e ZnSO 4 à aplicação inicial ou reaplicação dos aditivos, acrescidos de uma testemunha (cama sem aditivo). A reaplicação de Al 2 (SO 4 ) 3 e de ZnSO 4 otimizou a retenção de N nas camas, enquanto a de CuSO 4 foi necessária para aumentar o teor de N. A reaplicação de FeSO 4 não alterou o teor de N na maravalha, mas foi necessária para aumentar a rentenção na cama reutilizada. Com o segundo capítulo da Tese objetivou-se avaliar a retenção de N em camas de frango tratadas com aditivos químicos e os efeitos da aplicação desses materiais sobre o solo e plantas de milho. Dois experimentos em frascos abertos (1 - cama de frango de primeiro e 2 - cama de frango de segundo lote) foram realizados sob delineamento inteiramente casualizado com dez repetições, avaliando-se cinco aditivos químicos e uma testemunha: Al 2 (SO 4 ) 3 , CuSO 4 , FeSO 4 , ZnSO 4 , NBPT e ausência de aditivos. Todos os aditivos aumentaram a retenção de N nas camas. As aplicações de Al 2 (SO 4 ) 3 , CuSO 4 , FeSO 4 e ZnSO 4 acidificaram as duas camas, enquanto a de NBPT apenas reduziu a atividade da urease. Dois experimentos com plantas em vasos com solo (1 - cama de frango de segundo lote e 2 - cama de frango de terceiro lote) foram montados conforme um delineamento em blocos casualizados com 10 repetições, onde se avaliaram as camas de frango enriquecidas com aditivos químicos [Al 2 (SO 4 ) 3 , FeSO 4 , ZnSO 4 e NBPT] e duas testemunhas (cama de frango sob ausência de aditivos químicos e ausência de adubação). As camas tratadas com Al 2 (SO 4 ) 3 aumentaram a acidez potencial e o teor de S no solo, além do acúmulo de biomassa, conteúdo N e de S e índice de balanço de N. As adubações com as camas tratadas com CuSO 4 , FeSO 4 e ZnSO 4 acidificaram o solo, aumentaram o acúmulo de biomassa e o conteúdo de N nas plantas, assim como o de Cu, Fe e Zn, repectivamente. As adubações com as camas tratadas com NBPT aumentaram o conteúdo de N nas plantas. No terceiro capítulo da Tese objetivou-se avaliar os processos associados à mineralização do N em cama de frango tratada com aditivos químicos. Quatro experimentos de incubação foram montados conforme um delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições, avaliando-se nove aditivos químicos e uma testemunha: Al 2 (SO 4 ) 3 , fosfogesso, S 0 , H 3 BO 3 , ZnSO 4 , FeSO 4 , CuSO 4 , sais combinados (H 3 BO 3 + ZnSO 4 + FeSO 4 + CuSO 4 ), NBPT e ausência de aditivos. Nas camas tratadas com Al 2 (SO 4 ) 3 e FeSO 4 a acidificação diminuiu a emissão de NH 3 e, consequentemente, aumentou a retenção de N. O fosfogesso manteve os valores de respiração basal e de atividade da urease elevados ao longo do tempo e acarretou grande perda de NH 3 . O S 0 favoreceu a respiração microbiana e causou lenta acidificação da cama. As aplicações de H 3 BO 3 e ZnSO 4 diminuíram a respiração basal e a quantidade de NH 3 volatilizada. As aplicações de CuSO 4 e de sais combinados reduziram o pH, a respiração basal e a atividade da urease, resultando em baixa emissão de NH 3 . O NBPT inibiu a atividade da urease e acarretou grande acúmulo de ureia na cama, mas possibilitou perda gradual de NH 3 ao longo do tempo. O N mineralizado na cama de frango pode ser retido na estrutura dos minerais Tschermigita e Amôniojarosita. Palavras-chave: pH. Urease. Respiração microbiana. Volatilização de NH 3 .

Os γ-alquilidenobutenolídeos são unidades estruturais presentes em muitos compostos naturais e sintéticos responsáveis pelas diversas atividades biológicas, incluindo fitotoxicidade e citotoxicidade. A primeira parte deste trabalho refere-se à síntese de dois novos γ-alquilidenobutenolídeos, os quais foram submetidos à avaliação de suas atividades como inibidores da urease. O material de partida, o ácido mucobrômico (21), foi reduzido com boroidreto de sódio, e após acidificação obteve-se a lactona 3,4-dibromofuran-(5H)-ona (22) em 87% de rendimento. A lactona (22) foi submetida a um acoplamento cruzado por meio da reação de Suzuki- Miyaura, utilizando os ácidos 5-bromo-2-metoxifenilborônico e 5-cloro-2- metoxifenilborônico, e produzindo os compostos 3-bromo-4-(5-bromo-2-metoxifenil) furan-2(5H)-ona (23) e 3-bromo-4-(5-cloro-2-metoxifenil)furan-2(5H)-ona (24), em 41,0% e 57,0% de rendimento, respectivamente. O composto (23) foi submetido a uma reação de alquilidenação com 3,4-dimetoxibenzaldeído, obtendo-se o composto (Z/E)-3-bromo-4-(5-bromo-2-metoxi-fenil)-5-(3,4-dimetoxibenzilideno)furan-2(5H)-ona (25), em 75% de rendimento. Finalmente, o composto (25) foi submetido a uma reação para remoção dos grupos metila com BBr3, obtendo-se o composto (Z/E)-3- bromo-4-(5-bromo-2-hidroxifenil)-5-(3,4-dihidroxibenzilideno)furan-2(5H)-ona (26) em 90% de rendimento. O composto (26), na concentração de 500 μM, causou 100% de inibição da urease comparado com o padrão tiouréia; já o composto (25), na mesma concentração, foi bem menos ativo, causando apenas, 29% de inibição da urease. Na segunda parte do trabalho, buscou-se sintetizar γ-alquilidenobutenolídeos mediante a reação de condensação entre aldeídos e butenolídeos simples. Iniciamos nosso estudo partindo da 3,4-dibromofuran-(5H)-ona (22), 3,4- diclorofuran(5H)-ona (15) e furan-2(5H)-ona (37), juntamente com o benzaldeído (38) e o 2-clorobenzaldeído (39). Diversas condições reacionais foram testadas e verificou-se que as melhores condições para a condensação envolvem o uso de metanol como solvente e carbonato de sódio como base. Nesses experimentos, foram obtidos os intermediários 3,4-dibromo-5-[(2-clorofenil)hidroximetil]furan-2(5H)- ona (30) e 3,4-dicloro-5-[(2-clorofenil)hidroximetil]furan-2(5H)-ona (32), ambos em 40,0% respectivamente. Para avaliar a influência do impedimento estérico causado pelo substituinte no carbono 4 da lactona, a reação foi realizada com o butenolídeo bromado (23). Nesse caso, obteve-se um composto não esperado identificado como [4-(5-bromo-2-metoxifenil)]-5-metoxifuran-2(5H)-ona (36), com 74,0% de rendimento. Todos os compostos foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia no infravermelho (IV), ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e de 13C, técnicas bidimensionais como COSY e HSQC e por espectrometria de massas (EM).