Several gene deviations can be responsible for triggering oncogenic processes. However, mutations in tumour suppressor genes are usually more associated to malignant diseases, with p53 being one of the most affected and studied element. p53 is implicated in a number of known cellular functions, including DNA damage repair, cell cycle arrest in G1/S and G2/M and apoptosis, being an interesting target for cancer treatment.

O vírus influenza é responsável por uma infeção muito contagiosa que afeta o sistema respiratório, convencionalmente designada por Gripe. Este vírus é constituído por uma cadeia simples de RNA “negative sense” pertencente à família Orthomyxoviridae. O vírus influenza apresenta vários antigénios de superfície como a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA). A HA é o glicopéptido responsável pela entrada do vírus nas células do hospedeiro e tem correlação direta com a proteção contra o vírus, uma vez que induz a produção de anticorpos neutralizantes. Vários estudos têm demonstrado que o insert HA contido nas vacinas de DNA usadas esperimentalmente permitem conferir protecção cruzada contra várias estirpes do vírus, o que justifica a sua escolha para este projecto. Por outro lado, a NA é responsável pela saída do vírus da célula infetada permitimdo a sua propagação. É de referir ainda a proteína M2, um canal proteico transmembranar responsável pela replicação do vírus. Segundo dados da organização mundial de saúde em dezembro de 2015, as infeções respiratórias são mais frequentemente causadas por influenza do tipo A e B, sendo que a elevada propagação do vírus pelos vários continentes contribui para a ocorrência de mutações e aparecimento de novas estirpes. Assim, todos os anos vários milhares de pessoas são hospitalizadas devido a complicações da gripe, havendo uma taxa de mortalidade considerável, em especial em indivíduos com idade superior a 65 anos e com patologias preexistentes. Deste modo, a prevenção passa pelo reforço anual do sistema imunitário o que é conseguido de forma mais rápida e efetiva mediante a aplicação de vacinas. O objetivo da vacinação é controlar ou diminuir os sinais de infeção e é especialmente importante para indivíduos de elevado risco. As vacinas convencionais contra influenza são preparadas sazonalmente e são específicas para uma determinada estirpe, ou seja, a imunidade gerada não é particularmente ampla e a sua eficácia depende do grau de correspondência entre a vacina e a estirpe circulante. Como alternativa, a utilização do DNA plasmídico (pDNA) como uma vacina não viral tem-se tornado numa potencial estratégia terapêutica para prevenir ou tratar determinadas doenças de forma menos invasiva e segura comparando com os vetores virais. A vacinação de DNA consiste na injecção de DNA bacteriano geneticamente modificado com o gene de interesse que expressa proteínas antigénicas responsáveis por desencadear uma resposta imunológica, evitando a progressão da doença. Estas vacinas oferecem uma série de vantagens quando comparadas às vacinas clássicas, em termos económicos e técnicos. O controlo de qualidade é mais fácil e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas. Além disso, as vacinas de DNA induzem uma resposta imunitária celular através da produção de linfócitos T auxiliares (CD4+) e linfócitos T citotóxicos (CD8+) e também uma resposta humoral por produção de linfócitos B. O pDNA usado na produção de vacinas deve conter vários elementos funcionais para garantir a sua propagação (origem de replicação procariótica) e seleção em microrganismo bacterianos (marcador de seleção, como por exemplo a resistência a um antibiótico). Adicionalmente, deve apresentar elementos responsáveis por uma elevada expressão nos hospedeiros eucarióticos (promotor de expressão eurariótica, sinal de poliadenilação, sítio de múltipla clonagem) e ativação do sistema imunitário (gene de interesse). O pDNA para fins terapêuticos deve estar em conformidade com as especificações das agências reguladoras, seguindo rigorosos critérios de qualidade em termos de uso de reagentes tóxicos ou de origem animal, bem como de pureza relativamente aos restantes constituintes dos lisados celulares. Contudo, as semelhanças existentes entre o pDNA e os seus contaminantes comuns, como proteínas, endotoxinas, DNA genómico e RNA, podem complicar a sua separação, pelo que o processo de purificação deverá ser extremamente eficiente. Portanto a preparação destas vacinas de DNA requer o desenvolvimento de processos de produção e purificação que permitam obter grandes quantidades de plasmídeo na sua forma mais compacta e biologicamente ativa (isoforma superenrolada (sc)). Hoje em dia qualquer processo para obtenção de vacinas de DNA requer a utilização de métodos cromatográficos para obtenção do plasmídeo sc na sua forma mais pura. A cromatografia é uma técnica quantitativa que tem por finalidade geral a identificação e a separação dos componentes de uma mistura. Os compostos presentes são distribuídos entre uma fase estacionária e uma fase móvel e a separação ocorre porque os compostos têm diferentes afinidades com a fase estacionária e com a fase móvel, portanto deslocam-se com diferentes velocidades. Os métodos cromatográficos exploram propriedades do pDNA como tamanho, hidrofobicidade, carga e a afinidade das suas bases para os ligandos, de modo a promover a separação das impurezas com a maior eficiência possível. A flexibilidade deste tipo de processo advém da grande variedade de suportes e ligandos que podem ser usados, tendo em conta as características da molécula a separar. Em relação aos suportes cromatográficas existentes, alguns problemas ainda precisam de ser ultrapassados, como a baixa capacidade de ligação dos suportes, o tempo do processo de purificação das biomoléculas e os rendimentos de recuperação. Apesar dos bons resultados obtidos com as matrizes convencionais há necessidade de utilizar novas matrizes com melhor performance. Os monolitos poderão ser uma alternativas às matrizes convencionais uma vez que mostram várias vantagens em relação a estas, nomeadamente: elevada capacidade de ligação devido às excelentes propriedades de transferência de massa; separação mais rápida o que leva a uma baixa degradação; resolução independente do caudal; fácil manuseamento e elevada reprodutibilidade. Desta forma, o trabalho apresentado nesta tese consistiu na utilização de colunas monolíticas com a finalidade de purificar a isoforma sc da vacina de DNA NTC 7482-41H-VA2 HA com 6.471kbp que contém o codão de iniciação e sequência necessária para expressar a HA do vírus influenza. Numa fase inicial, foram realizados vários ensaios com plasmídeos modelo de diferentes tamanhos (até 14 kbp) utilizando o monolito CarbonylDiImidazole (CDI) não derivatizado. Este ligando foi escolhido pelas suas semelhanças com a coluna histidina agarose previamente utilizada com sucesso na purificação de um plasmideo modelo. Plasmídeos maiores necessitaram de menor concentração de sal (sulfato de amónio) para ligar ao monolito devido ao maior número de interações entre estas biomoléculas e o monolito. A caracterização do suporte foi possível através da determinação da capacidade dinámica de ligação (DBC) por variação de parâmetros como o tamanho do plasmídeo, força iónica, caudal e o pH da fase móvel. Verificou-se que quanto maior concentração de sal usada, menor a repulsão electrostática dos grupos fosfato no pDNA, o que torna estas moléculas mais compactas aumentando a DBC. Por outro lado, observou-se que para o mesmo caudal, plasmídeos maiores possuem menor DBC, uma vez que ocupam maior área de superfície dentro dos canais do monolito. Por fim, constatou-se que a diminuição do pH também tem uma influência positiva na DBC. No seguimento do trabalho, foi também testado um supporte monolítico imobilizado com agmatina para a purificação da vacina de pDNA contra o vírus influenza. A agmatina é naturalmente sintetizada a partir do aminoácido arginina na forma descarboxilada, e é conhecida pela sua intervenção em inúmeros processos biológicos. As semelhanças estruturais da agmatina com o seu precursor arginina, previamente utilizado como ligando numa coluna de agarose para purificar sc pDNA, foram a razão de escolha para o propósito aqui referido. A agmatina foi pela primeira vez usada como ligando em processos cromatográficos, verificandose que possui a particularidade de funcionar sob dois modos de interação, o que permitiu a aplicação de duas estratégias de purificação: gradiente por diminuição da concentração de sulfato de amónio ou por aumento da concentração de cloreto de sódio. Os melhores resultados foram obtidos com a estratégia que usa sulfato de amónio, atingindo-se um grau de pureza de 98 % e um rendimento de 51,8 %. Adicionalmente, o método apresentou uma elevada DBC (5.656 mg/mL) e uma redução significativa das impurezas do hospedeiro quando comparadas com o lisado injectado no monolito. A eficiência de transfeção nos fibroblastos transfectados com o pDNA sc purificado com esta estratégia foi de 73 %. Por último, a implementação de uma abordagem baseada em cromatografia de troca iónica utilizando o monolito com o ligando etilenodiamina (EDA) para a purificação do pDNA sc com expressão do gene HA do vírus influenza foi também bem sucedida. Este último ligando funciona por troca aniónica e possui semelhanças estruturais com o ligando DEAE, previamente utilizado como método analítico para quantificação de impurezas e da isoforma sc em amostras de pDNA. O processo permitiu uma redução significativa das impurezas provenientes do hospedeiro E. coli obtendo-se um grau de pureza de 97,1% e um redimento de 47%. Após a verificação dos padrões de qualidade do pDNA sc purificado, foram realizados ensaios in vitro com 2 tipos de células (A549 e CHO). A expressão da HA determinada por imunofluorescência permitiu verificar uma maior eficiência de transfecção nas células CHO com cerca de 70,6 %, enquanto as células A549 apenas registaram uma eficiência de transfecção de 61,4 %. De entre todos os métodos cromatográficos utilizados, o EDA permitiu obter um processo mais rápido e com menor impacto económico. No global, este projeto de doutoramento demonstrou que os monolitos possuem um grande potencial de aplicação em processos cromatográficos para a purificação de vacinas de DNA obtidas a partir de lisados complexos de E. coli seguindo as exigências das agências reguladoras. Apesar de os monolitos utilizados com os ligandos acima referidos apresentarem valores de rendimento e purificação relativamente semelhantes às matrizes particuladas convencionais, a elevada capacidade dos monolitos permite uma maior rapidez e eficiência do processo de purificação.

Mitochondrial gene therapy seems to be a valuable and promising strategy to treat mitochondrial disorders. The use of a therapeutic vector based on mitochondrial DNA, along with its affinity to the site of mitochondria, can be considered a powerful tool in the reestablishment of normal mitochondrial function. In line with this and for the first time, we successfully cloned the mitochondrial gene ND1 that was stably maintained in multicopy pCAG-GFP plasmid, which is used to transform E. coli. This mitochondrial-gene-based plasmid was encapsulated into nanoparticles. Furthermore, the functionalization of nanoparticles with polymers, such as cellulose or gelatin, enhances their overall properties and performance for gene therapy. The fluorescence arising from rhodamine nanoparticles in mitochondria and a fluorescence microscopy study show pCAG-GFP-ND1-based nanoparticles' cell internalization and mitochondria targeting. The quantification of GFP expression strongly supports this finding. This work highlights the viability of gene therapy based on mitochondrial DNA instigating further in vitro research and clinical translation.

In recent years, non-viral delivery systems for plasmid DNA have become particularly important. They can overcome the disadvantages of viral systems such as insertional mutagenesis and unpredicted immunogenicity. Some additional advantages of non-viral gene delivery systems are; good stability, low cost, targetability, delivery of a high amount of genetic materials. The aim of the study was to develop novel non-viral nanosystems suitable for gene delivery. Two formulations were developed for this purpose: water-in-oil microemulsion (ME) and solid lipid nanoparticles (SLN). The microemulsion was composed of Peceol, Tween 80, Plurol oleique, ethanol and water. The SLN was consisting of Precirol, Esterquat-1 (EQ1), Tween 80, Lecithin, ethanol and water. Characterization studies were carried out by measuring particle size, zeta potential, viscosity and pH. TEM imaging was performed on SLN formulations. Protection against DNase I degradation was examined. Cytotoxicity and transfection efficacy of selected formulations were tested on L929 mouse fibroblast cells. Particle sizes of complexes were below 100 nm and with high positive zeta potential. TEM images revealed that SLNs are spherical. The SLN:DNA complexes have low toxicity and good transfection ability. All results showed that the developed SLN formulations can be considered as suitable non-viral gene delivery systems.

Extracellular Vesicles (EVs) have emerged as pivotal mediators of intercellular communication with significant potential as therapeutic agents, especially in the context of cardiovascular disease (CVDs) such as myocardial infarction (MI), which remains a debilitating condition affecting millions worldwide.Small Extracellular Vesicles (sEVs) are nanovesicles released from cells, through different biogenetic and secretory mechanisms. These serve as shuttles mediating cellular communication by carrying a variety of molecules resulting from intracellular homeostatic mechanisms. Due to their ability to integrate and functional deliver biomolecules, such as microRNAs (miRNAs) and other oligonucleotides to desired cells, sEVs have emerged as highly attractive candidate for targeted therapy in MI. There are two main different ways to modulate sEVs cargo by either pre- or post-isolation modifications. This study investigates strategies to modulate sEVs, enhancing their therapeutic potential, with a particular focus on a bioengineering approach that allow precise cargo loading, using post-isolation loading through peptide-mediated aggregation. We will be using P6 peptide modulated with sEVs as novel and efficient method for the incorporation of therapeutic miRNAs. Promoting modulations with one- or two-step purifications and accessing different oligonucleotides. The application of peptide modulation has been extensively investigated due to the advantages it offers, such as biocompatibility, stability and therapeutic outcomes. Furthermore, the therapeutic potential of miRNA-loaded sEVs in the context of MI has been critically evaluated given sEVs qualities, low toxicity and the capacity to encapsulate and protect endogenous bioactive molecules while maintaining activity across diverse species. Throughout this study, we aim to unlock new possibilities in cardiac regenerative medicine, thereby improving patient outcomes and help alleviating the burden of CVDs on both individuals and healthcare systems as soon as possible.

A terapia genética caracteriza-se pela entrega de ácidos nucleicos às células de um indivíduo para compensar genes anormais ou com o objetivo de produzir uma proteína benéfica. Além disso, a terapia genética apresenta grandes vantagens para a área da vacinação, uma vez que é esperado que as vacinas de DNA gerem uma resposta imune tanto humoral, como celular, propiciando estratégias de vacinação profiláticas e também terapêuticas. Comparativamente aos sistemas de entrega viral, os vetores não-virais são uma alternativa mais segura, com poucos efeitos secundários, muito estáveis e suscetíveis a modificações físico-químicas. Entre estes sistemas transportadores, o quitosano, um polímero catiónico, tem suscitado interesse como vetor não-viral devido à sua biodegradabilidade, biocompatibilidade, baixa toxicidade e capacidade de interagir com as moléculas de DNA carregadas negativamente, formando facilmente poliplexos. No entanto, alguns autores afirmam que a interação entre as cargas opostas dos grupos amino do quitosano e dos grupos fosfato no ácido nucleico origina complexos muito estáveis, impedindo a libertação do DNA e causando baixa transfecção. Para superar esta limitação, formulámos a hipótese de que a adição de caseína, assim como o glucano, na estrutura das nanopartículas facilitaria uma transferência do DNA mais adequada.O trabalho aqui apresentado visa produzir Nanopartículas de Quitosano-α-Caseína (ChiCas NPs) e testar sua capacidade como um sistema de entrega de DNA através de estudos in vitro de transfecção. Os resultados obtidos demonstram que as ChiCas NPs, apresentando tamanhos pequenos e homogéneos com pequenas variações entre as diferentes formulações (variando entre 230 nm e 390 nm) e potenciais zeta marcadamente positivos (> 32 mV), possuem características e estabilidade adequadas para serem um bom candidato para um sistema de entrega génica. Deste modo, os resultados dos ensaios de complexação de DNA confirmaram a produção com sucesso de complexos NPs:DNA, seja com DNA adsorvido à superfície das NPs, ou com DNA incorporado nas NPs. Nos estudos preliminares com várias formulações constituídas por diferentes rácios de NPs:DNA observou-se uma baixa eficiência de transfecção, comparativamente ao controlo positivo.Para concluir, os resultados apresentados sugerem que as ChiCas NPs têm a capacidade de atuar como um sistema de entrega de genes, no entanto, é necessária uma investigação mais aprofundada para otimizar os rácios ChiCas NPs:DNA e assim obter uma formulação de DNA plasmídico bem-sucedida.

In the present work, we used a novel albumin-associated lipoplex formulation, containing the cationic lipid 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EPOPC) and cholesterol (Chol), to evaluate the antitumoral efficacy of two gene therapy strategies: immuno-gene therapy, mediated by IL-12 gene expression, and "suicide" gene therapy, mediated by HSV-tk gene expression followed by ganciclovir (GCV) treatment. Our data show that, in an animal model bearing a subcutaneous TSA (mouse mammary adenocarcinoma) tumor, intratumoral administration of the albumin-associated complexes containing the plasmid encoding IL-12 results in a strong antitumoral effect, as demonstrated by the smaller tumor size, the higher T-lymphocyte tumor infiltration and the more extensive tumor necrotic and hemorrhagic areas, as compared to that observed in animals treated with control complexes. On the other hand, the application of the "suicide" gene therapy strategy results in a significant antitumoral activity, which is similar to that achieved with the immuno-gene therapy strategy, although involving different antineoplastic mechanisms. For the tested model, albumin-associated complexes were shown to efficiently mediate intratumoral delivery of therapeutic genes, thus leading to a significant antitumoral effect. This finding is particularly relevant since TSA tumors are characterized for being poorly immunogenic, aggressive and exhibiting high proliferation capacity.

We characterized different cationic lipid-based gene delivery systems consisting of both liposomes and nonliposomal structures, in terms of their in vitro transfection activity, resistance to the presence of serum, protective effect against nuclease degradation and stability under different storage conditions. The effect of lipid/DNA charge ratio of the resulting complexes on these properties was also evaluated. Our results indicate that the highest levels of transfection activity were observed for complexes prepared from nonliposomal structures composed of FuGENE 6. However, their DNA protective effect was shown to be lower than that observed for cationic liposome formulations when prepared at the optimal (+/-) charge ratio. Our results suggest that lipoplexes are resistant to serum up to 30% when prepared at a 2:1 lipid/DNA charge ratio. However, when they were prepared at higher (+/-) charge ratios, they become sensitive to serum for even lower concentrations (10%). Replacement of dioleoyl-phosphatidylethanolamine (DOPE) by cholesterol enhanced the resistance of the complexes to the inhibitory effect of serum. This different biological activity in the presence of serum was attributed to different extents of binding of serum proteins to the complexes, as evaluated by the immunoblotting assay. Studies on the stability under storage show that lipoplexes maintain most of their biological activity when stored at -80 °C, following their fast freezing in liquid nitrogen.

In the present study, the effect of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate (DMAEMA) conjugation onto branched poly(ethylenimine) (PEI) with different grafting degree was examined for gene delivery applications. The DMAEMA-grafted-PEI conjugates were characterized and complexed with plasmid DNA (pDNA) at various concentrations, and the physicochemical properties, cell viability, and in vitro transfection efficiency of the complexes were evaluated in HEK 293T cells. Computational techniques were used to analyze the interaction energies and possible binding modes between DNA and conjugates at different grafting degrees. The cytotoxicity analysis and in vitro transfection efficiency of the conjugate/pDNA complexes exhibited a beneficial effect of DMAEMA conjugation when compared to PEI alone. The computational results revealed that the DNA/vector interaction energy decreases with increasing grafting degree, which can be associated to an enhanced release of the pDNA from the carrier once inside cells. The results indicate the significance of DMAEMA conjugation onto PEI as a promising approach for gene delivery applications.

Herein, we report an easy and ingenious method to functionalize magnetic iron oxide nanoparticles (MNPs) with plasmid DNA (pDNA) to obtain nanohybrid systems suitable for nucleic acid therapy. The nanohybrids were prepared by combining complexes of dendrimers and pDNA (dendriplexes) and poly(styrene) sulfonate-coated MNPs through electrostatic interactions. The effects of the dendrimer generation (generations 2, 4 and 6) and the amine to phosphate group (N/P) ratio on the hydrodynamic diameter, zeta potential, cell viability, cellular internalization and transfection efficiency of the nanohybridswere systematically investigated at different transfection conditions (including incubation time, pDNA concentration, presence or absence of an external magnetic field, and presence or absence of fetal bovine serum). The results confirmed that the nanohybrids were able to transfect NIH 3T3 cells, and that the level of gene expression (the luciferase protein reporter gene was used) was strongly dependent on the dendrimer generation, the N/P ratio, and the pDNA concentration. The best system was based on dendriplex-coated MNPs formed by generation 6 dendrimers at an N/P ratio of 10 that, at optimized conditions, led to a gene expression level which was not significantly different from that obtained only using dendriplexes. In summary, a coherent set of results was reached indicating the potential of the developed nanohybrids as effective gene delivery nanomaterials.