Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza, da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientador: Prof. Dr. Francisney Pinto do Nascimento e Coorientador: Prof. Dr. Elton Gomes da Silva

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências, do Instituto Latino-Americano de Ciências da Vida e da Natureza, da Universidade Federal da Integração Latino-Americana, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências, área de concentração Biociências.

Cannabis sativa L. is one of the most consumed drugs in the world and recent studies have associated its use with an increase in the number of traffic accidents in different countries. In many countries, like Brazil, simple and reliable methodologies are still needed for the detection of drugs on site, mainly cannabinoids, considering its prevalence of use and oral fluid (OF) has been proved as an appropriate biological matrix for this purpose. Considering that, this work aims to review previous studies on immunochromatographic devices for on-site detection of cannabinoids in OF, discussing their sensitivity, specificity, cut-offs values and confirmatory methods. This data shows the importance of choosing a screening device and it reinforces the need for its implementation in Brazil. The research was conducted on 5 databases and all original articles, published in the last 10 years, were selected. A total of 32 articles were found, providing data for 17 screening devices of distinct brands. Only 2 screening devices showed satisfactory sensitivity and specificity in the evaluated studies (≥80% and ≥90% respectively). However, it should be considered that the screening devices still have some limitations, such as a higher cut-off than those recommended by international guidelines (cut-off > 2 ng/mL), therefore demonstrating the need for more studies in the area and the importance of confirmatory analysis usually fulfilled by LC-MS/MS, GC-MS/MS or GC-MS. Thus, the screening analyzes should not be evaluated by itself, but in association with confirmatory results and observational traits (behavioral changes), for a better understanding of the traffic scenario.

The use of natural products in dermatology is increasingly being pursued due to sustainability and ecological issues, and as a possible way to improve the therapeutic outcome of chronic skin diseases, relieving the burden for both patients and healthcare systems. The legalization of cannabis by a growing number of countries has opened the way for researching the use of cannabinoids in therapeutic topical formulations. Cannabinoids are a diverse class of pharmacologically active compounds produced by Cannabis sativa (phytocannabinoids) and similar molecules (endocannabinoids, synthetic cannabinoids). Humans possess an endocannabinoid system involved in the regulation of several physiological processes, which includes naturally-produced endocannabinoids, and proteins involved in their transport, synthesis and degradation. The modulation of the endocannabinoid system is a promising therapeutic target for multiple diseases, including vascular, mental and neurodegenerative disorders. However, due to the complex nature of this system and its crosstalk with other biological systems, the development of novel target drugs is an ongoing challenging task. The discovery of a skin endocannabinoid system and its role in maintaining skin homeostasis, alongside the anti-inflammatory actions of cannabinoids, has raised interest in their use for the treatment of skin inflammatory diseases, which is the focus of this review. Oral treatments are only effective at high doses, having considerable adverse effects; thus, research into plant-based or synthetic cannabinoids that can be incorporated into high-quality, safe topical products for the treatment of inflammatory skin conditions is timely. Previous studies revealed that such products are usually well tolerated and showed promising results for example in the treatment of atopic dermatitis, psoriasis, and contact dermatitis. However, further controlled human clinical trials are needed to fully unravel the potential of these compounds, and the possible side effects associated with their topical use.

Nos últimos anos tem vindo a verificar-se um aumento na prevalência das doenças cardiovasculares, constituindo atualmente uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. Concomitantemente foi também observado um aumento não só na utilização de canábis para fins recreativos, mas também para fins medicinais devido aos avanços na compreensão da fisiologia do sistema endocanabinóide. Estes níveis de consumo levam ao aparecimento de questões acerca da sua implicação na saúde humana, sendo importante a investigação e compreensão dos efeitos desta substância, nomeadamente a nível cardiovascular dada a existência de publicações que constataram uma possível ligação entre o seu consumo e o desenvolvimento de patologias cardiovasculares. A realização de estudos envolvendo os principais constituintes desta planta e a própria planta para a investigação destes efeitos é ainda escassa e constitui uma lacuna na interpretação de uma possível relação causa-efeito. Os estudos com os principais canabinóides isolados, o CBD e o THC, reportaram diferentes efeitos consoante o desenho do estudo e a espécie animal utilizada, mostrando, no entanto, alguns efeitos cardiovasculares benéficos em determinadas situações, como na hipertensão e no enfarte agudo do miocárdio. Ainda assim, apesar destes possíveis benefícios com os seus componentes maioritários, os relatos do uso da canábis caracterizam-na como um fator de risco, tendo induzido o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, de que são exemplo a doença cardíaca isquémica e arritmias. Contudo, estes estudos são essencialmente retrospetivos e não têm em conta outros fatores associados que possam levar a esse aumento do risco, não constituindo uma fonte robusta que permita o estabelecimento dessa relação causal, mostrando apenas uma relação temporal entre os mesmo. Devido a esta carência de estudos robustos e com variáveis de confundimento bem controladas, seria de elevado interesse e importância o desenho de estudos prospetivos controlados num futuro próximo que permitam avaliar e caracterizar de uma forma precisa a interação entre a canábis e o sistema cardiovascular.

The characterisation of cannabis plants, especially the determination of specific phytocannabinoids, has gained enormous importance in the last decade, mainly due to the recent changes in cannabis control in several countries or states. This is particularly relevant for the forensic, medical or recreative industry to have a rapid, inexpensive, and reliable methodology to identify and quantify phytocannabinoids. Furthermore, spiking cannabis products with Δ8-tetrahydrocannabinol (THC) is a contemporary trend that demands improving or replacing current methods to include this cannabinoid. The current study presents an ultrasound-assisted solid-liquid extraction followed by high-performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) methodology to identify and quantify Δ9-THC, Δ8-THC, cannabidiol, cannabinol, Δ9-tetrahydrocannabinolic acid and cannabidiolic acid in cannabis products. The herbal samples were extracted with ethanol:acetonitrile (50:50, v:v) by ultrasonication using only 50 mg of sample. The plant oils were diluted in ethanol. The optimised procedure allowed ≈100% extraction efficiency of the target cannabinoids. The validation assays showed that the method is linear (R2 > 0.997), selective, sensitive, precise and accurate, with suitable limits of detection (0.125–0.250 µg mL−1) and quantification (0.500 µg mL−1). The method was successfully applied to cannabis samples, demonstrating its suitability for routine analyses. This contribution follows the current demand for fast and straightforward analysis services of this plant and its derivatives, using small amounts of sample. The present study compares very favourably against other works, particularly in regards to the extraction efficiency, speed of the overall procedure, method sensitivity, and ability to monitor Δ8-THC spiked samples using a novel solvent mixture.

A Doença de Parkinson (DP) é uma patologia neurodegenerativa progressiva marcada pela degeneração dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra pars compacta e pela acumulação de agregados de alfa-sinucleína (αSyn). Embora os tratamentos atuais controlem os sintomas motores, não impedem a progressão da doença, tornando necessária a investigação de novas abordagens terapêuticas. O Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9THC) tem demonstrado propriedades neuroprotetoras, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e moduladores da autofagia. No entanto, permanece pouco estudado o seu impacto direto (ou o dos seus metabolitos, como o Δ9THCA) na estrutura de proteínas envolvidas na patogénese da DP, como a αSyn. Neste estudo, foi produzida αSyn humana recombinante e purificado Δ9THCA por HPLC, avaliando-se por dicroísmo circular (CD) o efeito deste composto na estrutura secundária da proteína. Como a produção de aSyn é um processo moroso, começámos por testar a hipótese do Δ9THCA interaccionar com uma proteína adquirida comercialmente, a BSA. Os resultados mostraram que o Δ9THCA estabiliza a BSA e aumenta o seu conteúdo em hélice-α. No caso da αSyn, verificou-se uma redução consistente da fração desordenada (de ~0,43 para ~0,31), indicando uma modulação conformacional discreta, mas mensurável, mantida durante pelo menos 24 horas. Apesar de não induzir a formação de estruturas rigidamente definidas, o Δ9THCA parece alterar a flexibilidade conformacional da αSyn, podendo alterar a sua tendência para agregação. Este trabalho sugere que o Δ9THCA pode interferir com o estado estrutural da αSyn, justificando investigações adicionais sobre o seu impacto na agregação proteica e em modelos celulares. Os resultados contribuem também para o debate científico e legal sobre o potencial terapêutico dos canabinoides na DP, cuja aplicação clínica futura requer validação adicional in vitro, in vivo e em contexto clínico.

O sistema endocanabinóide (ECS) é um componente crítico do sistema nervoso central (CNS) em desenvolvimento e afeta vários processos fisiológicos no SNC adulto, incluindo a sua interação com o sistema imune. Este facto é relevante para a neuroinflamação subjacente a doenças neurológicas e psiquiátricas, incluindo a toxicodependência.Os canabinóides sintéticos (SCs) estão entre as novas substâncias psicoativas (NPS) mais consumidas na Europa. No entanto, as suas toxicidades imprevisíveis e uso indevido tornam a sua utilização uma preocupação de saúde pública. Tanto o Δ9-tetrahidrocanabinol (THC) como os SCs estimulam os mesmos recetores, o recetor de canabinóides 1 (CB1) e o recetor de canabinóides 2 (CB2), que há muito tempo se sabe que tem um potencial imunomodulador. Entre os SCs, o ADB-FUBINACA e o THJ-2201 surgiram nos últimos anos, mas quase nada se sabe sobre os seus perfis toxicológicos e dependência. É importante salientar que o impacto destes novos SCs no sistema imunitário, incluindo nas células dendríticas (DCs), que são células apresentadoras de antigénios que fazem a ligação entre a imunidade inata e adaptativa, e são essenciais para manter a homeostase do sistema imune e a autotolerância, também é incerto.Este estudo tem como objetivo investigar o impacto de dois SCs comummente detetados em convulsões (por exemplo, ADB-FUBINACA e THJ-2201) e do fitocanabinoide THC no imunofenótipo das DCs circulantes humanas. A nossa análise incluiu uma avaliação das populações e subpopulações de DCs sob inflamação induzida por LPS, bem como a quantificação dos níveis de expressão de IDO1 nestas células imunitárias utilizando citometria de fluxo. Além disso, medimos a expressão de duas citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e IFN-γ, no sangue humano periférico, utilizando a técnica sandwich ELISA. Importa realçar que a subpopulação de duplamente negativa (DN) CD16+apresentou uma diminuição sob inflamação induzida por LPS, ao contrário das outras subpopulações onde esta alteração foi mínima. Os canabinóides testados tiveram um impacto reduzido na expressão de IDO1 durante a inflamação, tanto no total de DCs como nas suas subpopulações. A análise de citocinas no sangue humano mostrou que o LPS aumentou os níveis de IL-1β e IFN-γ. Em comparação com o LPS, ambos os SCs apresentaram uma tendência para diminuir os níveis de citocinas, o que pareceu ser menos pronunciado na presença de THC.Em conclusão, os nossos resultados sugerem que as vias de sinalização que medeiam a expressão da IDO1 em DCs não são significativamente afetadas pelos canabinóides. Além disso, os SCs, particularmente o THJ-2201, demonstraram potencial para diminuir os níveis de IFN-γ sob inflamação induzida por LPS quando comparados com o grupo tratado com LPS. Esta investigação contribui para uma compreensão mais profunda do papel desempenhado pelosistema endocanabinóide na modulação do sistema imune e oferece informações sobre os efeitos imunológicos dos SCs. Dado o cenário em evolução do uso de canabinóides e o número limitado de participantes no nosso estudo, é essencial realizar estudos futuros mais aprofundados para explorar a interação entre as vias imunológicas, os efeitos dos canabinóides e o potencial imunomodulador inerente à população de DCs. Estes esforços irão ampliar o conhecimento nesta área e fornecerão informações valiosas para potenciais aplicações clínicas e estratégias terapêuticas nos vários contextos médicos.

O estágio curricular permite-nos integrar e aplicar os conhecimentos adquiridos ao longo do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas. O meu estágio foi realizado no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra e na Farmácia Figueiredo, em Coimbra, e os respetivos relatórios seguem o modelo de análise SWOT (Strengths, Weaknesses, Opportunities and Threats).A doença de Parkinson é uma patologia bastante comum a nível mundial, principalmente na população mais idosa, e resulta de uma degeneração neuronal e consequente perda de neurónios dopaminérgicos. As causas desta doença ainda são pouco conhecidas, mas já se sabe que tanto fatores genéticos como fatores ambientais podem contribuir para o aparecimento e desenvolvimento da mesma. Os tratamentos existentes atualmente têm como objetivo aumentar os níveis de dopamina, contudo mostram-se ineficazes relativamente à progressão da doença e alguns provocam efeitos colaterais prejudiciais para a qualidade de vida do doente, pelo que se torna necessário investigar e produzir novos fármacos capazes de impedir a evolução da doença de Parkinson e com efeitos adversos menos graves.É então que surge a oportunidade de apostar no desenvolvimento de novas terapêuticas anti-parkinsonianas, baseadas na administração de canabinóides ou seus análogos sintéticos. Isto porque o sistema endocanabinóide encontra-se implicado em diversos processos fisiológicos fundamentais na doença de Parkinson.Aparentemente, o sistema endocanabinóide apresenta importantes propriedades que serão úteis e benéficas no tratamento da doença de Parkinson, contudo, a cannabis bem como os canabinóides e todos os mecanismos envolvidos, são extremamente complexos, pelo que, apesar de todos os esforços para investigar o potencial terapêutico da planta de cannabis, ainda existem determinados tópicos menos conhecidos, que carecem de mais investigação.

O presente documento, composto por um Relatório de Estágio e por uma Monografia, foi elaborado no âmbito da unidade de Estágio Curricular, do 5º ano, do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.Na primeira parte, referente ao Relatório de Estágio, com recurso a uma análise SWOT (Strenghts, Weaknesses, Opportunities, Threats), encontra-se descrita a experiência do autor enquanto estagiário, na área de farmácia comunitária, explorando aquele que é o quotidiano de um farmacêutico de oficina.Na segunda parte, correspondente à Monografia, procurou-se estabelecer uma relação entre o uso da canábis e os distúrbios psiquiátricos. A canábis é a substância ilícita mais utilizada no Mundo e, como tal, a prevalência de alguns distúrbios psiquiátricos começou a ser associada ao seu consumo. Com a descoberta dos principais compostos desta planta, o tetra-hidrocanabinol (THC) e o canabidiol (CBD), foi também descoberto o sistema endocanabinóide que é responsável por regular diversas funções homeostáticas. Com a revisão de literatura concluiu-se que o abuso de preparações onde o THC é o composto mais abundante aumenta a probabilidade de desenvolver perturbações psiquiátricas. Quanto ao CBD, desprovido de atividade psicotrópica, está a tornar-se cada vez mais uma opção farmacológica para diversas patologias, entre as quais, a ansiedade, a depressão e a esquizofrenia. Embora os seus mecanismos ainda não estejam perfeitamente definidos, o futuro é bastante promissor no que toca a este composto.