Ischemic stroke (IS) remains one of the leading causes of death and disability worldwide, representing a major clinical and economic challenge. It is caused by the temporary or permanent interruption of a blood vessel, leading to disruption of the central nervous system and consequent neuronal loss. In the acute phase, therapeutic strategies include thrombolysis and thrombectomy to restore blood flow, whereas in the chronic phase, approaches aimed at promoting neural plasticity, such as cell therapy, are employed. However, these techniques face several limitations, as their efficacy is directly influenced by multiple variables, making their response unpredictable. Recent studies have attributed the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) mainly to their paracrine action, thus positioning the use of their secretome as a promising alternative. In this work, we evaluated the impact of secretome derived from umbilical cord MSCs (UC-MSCs), obtained under normoxic and hypoxic conditions, on neuronal viability and on the recovery of synaptic structure after oxygen and glucose deprivation (OGD) in vitro. The results suggest that the secretome can modulate cell survival, preserve the length of neuronal arborization processes, and modulate synaptic markers. Although some results are promising, further studies are required to explore alternative approaches in order to better understand the action of MSC-derived secretome in the treatment of ischemic stroke and other neurological disorders associated with hypoxicischemic injury.

Paracoccicoidioides is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a disease considered one of the main causes of mortality among systemic mycoses in Brazil. The success in establishing of the infection is related with the ability of fungus to adhere and degrade components of the extracellular matrix (ECM). Human plasminogen (hPlg) is a protein of blood plasma of the host that presents fibrinolytic activity when activated into plasmin. Many pathogens are able to subvert the plasminogen/plasmin system using linker molecules and promote the degradation of tissue barriers. In this work, we identified through Far Western and proteomic analysis, a total of 15 proteins secreted of Paracoccidioides that are plasminogen binding proteins. Those proteins are probable targets of the interaction of the fungus with the host and could contribute to the invasiveness of the fungus. The fructose 1,6-biphosphate aldolase was described in other organisms such as plasminogen binder and presentes participation in the adherence of Paracoccidioides to host cells. This protein selected for validation tests and their presence was observed on the surface and secretory vesicles of the fungus. FBA confirm the ability to convert plasminogen to plasmin in the presence of tissue plasminogen activator (tPA) and this interaction promoted the degradation of fibrin. In infection assays, the addition of antibodies blocking the FBA binding site reduced the interaction of the fungus with macrophages and the interaction of FBA with Plg increased the rate of cell invasion. These data suggest that the FBA can contribute to adhesion, invasion and spread process of the fungus.

The genus Trichoderma is represented by non-pathogenic soil fungi that have been studied by act as biological control agents against fungal pathogens, such as Sclerotinia sclerotiorum, the fungus that causes white mold, besides that, reduce environment and human health risks by being able to replace agrochemicals. Proteomic strategies with MS techniques have been important tools in studies of patterns identification for protein expression in different growth conditions. This work aims to development new strategies that enable the detection and identification of proteins secreted by Trichoderma asperellum (TR356) and Sclerotinia sclerotiorum when inoculated together and separated. The results obtained by MALDI / TOF analysis allowed the identification of a β-1.3--glucanosiltransferase and α-1.2-Dmannosidase, demonstrating the possibility of proteins identification for better comprehension about interaction between these organisms. It was therefore possible to identify the proteins through strategies used, but further analysis are required in order to elucidate the function and interaction of proteins secreted by the fungus Trichoderma asperellum TR356 against S. sclerotiorum.

Obesity is characterized by excessive fat in adipose tissue and continues to be described as a public health problem. In addition, it is associated with the development and worsening of comorbidities such as type II diabetes, cardiovascular diseases, hypertension and metabolic syndrome. Another public health problem focuses on antimicrobial resistance (AMR). Over time, they have been gaining alarming proportions worldwide, due to the ability to acquire new mechanisms of resistance threatening the treatment of infections acquired in the community and in hospitals, resulting in a prolonged illness, disability, and death. The state of obesity entails an imbalance in the production of proinflammatory and anti-inflammatory factors that contributes to infections’ susceptibility. This susceptibility translates into respiratory and skin barrier impairment, obesity-related comorbidities, slower healing and inefficient antimicrobial therapy. Bacteria’s alarming ability to gain resistance has raised concerning obstacles in antimicrobial therapies in patients with chronic inflammation, such as obese individuals. This study aimed to understand the influence of an inflammatory obesity-mimicking environment in the growth of Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa strains with different antibiotic resistance. For this, the cell lines Raw 264.7 (macrophages) and 3T3-L1 (adipocytes) were collected to serve as a conditioned medium for bacterial growth. All strains were exposed to a variety of conditioned media (DMEM, DMEM enriched with 10% and 50% adipocyte secretome (SA), macrophage secretome (SM) and macrophage secretome enriched with 10% and 50% SA). Results showed Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Klebsiella pneumoniae Carbapenem/ESBL are of greater risk factor in a SM environment. On the other hand, S.aureus, M. smegmatis, wild-type K.pneumoniae, K.pneumoniae ESBL, K.pneumoniae Carbapenem, E. coli and P. aeruginosa only seems to depend more on SA environment. Additionally, bacterial strains with AmpC resistance showed high risk to bacterial growth in environment enriched with SA. Overall, this study demonstrates that the kind of resistance and the environment in which each bacteria strain is present can contribute to the state of chronic inflammation.

Injury to the central nervous system (CNS) often results in permanent neurological impairments because axons fail to regenerate and rebuild the synaptic connections that were lost. Downregulation of neuron-intrinsic growth programs and the inhibitory environment present at the injury site constitute the main obstacles to axon regeneration. Therefore, the development of a strategy capable of stimulating the regrowth of injured axons in such restrictive conditions remains crucial. Mesenchymal stem cells (MSC) have been proposed as a promising therapeutic tool for traumatic nervous system disorders, due to their neuro-regenerative effects. These outcomes have been extensively connected to paracrine mechanisms rather than long-term engraftment and cell replacement in the injured tissue. Because synaptic reintegration of injured axons into existing circuitry is required for functional recovery, we investigated the regenerative and synaptogenic potential of MSC secretome. We combined in vitro assays with a mouse model of spinal cord injury (SCI) to fully characterize the secretome’s ability to restore functional connectivity in injured neurons. Application of MSC secretome to rat hippocampal and cortical neurons induces axonal branching and presynaptic differentiation. Additionally, we show that this synaptogenic effect is axonal intrinsic. Moreover, the number of axodendritic synapses also increases after treatment with MSC secretome. This increase in synapses correlates with an enhancement in synaptic activity, revealing that the new synapses induced by MSC secretome are functional. Together, this first set of results indicates that MSC secretome promotes the formation of functional synapses in developing CNS. Although the mechanisms that promote the reorganization of lost synaptic circuits in the adult CNS remain poorly characterized, several studies indicate that the same developmental signals that instruct synaptogenesis can be reactivated following injury. By performing axotomy in microfluidic chambers, we observed that MSC secretome promotes both axonal regeneration and presynaptic differentiation in injured CNS neurons. Moreover, systemic administration of the secretome reduces inflammation, promotes motor improvements, and alleviates neuropathic pain in mice after a T8 complete spinal cord transection. Overall, our results demonstrate that MSC secretome has regenerative and synaptogenic properties and induces functional restoration after SCI, revealing a potential role of the secretome as a future cell-free therapy to restore functional connectivity in the injured CNS.

A neurogénese adulta, um processo em que as células estaminais neurais (NSCs) endógenas se diferenciam numa vasta gama de linhagens neurais do cérebro, tem sido considerada como uma potencial estratégia terapêutica para travar a progressão de doenças neurológicas, incluindo a depressão. Recentemente, uma alteração de paradigma, veio sugerir que os efeitos benéficos das NSCs possam, também, depender da sua atividade parácrina, nomeadamente através da libertação de biomoléculas (secretoma). No entanto, ao longo da vida, as NSCs diminuem em número e perdem gradualmente a sua atividade parácrina em resposta à senescência cronológica e replicativa, tornando-se imprescindível a descoberta de estratégias exequíveis e eficientes para reforçar o papel terapêutico do secretoma das NSCs e compensar a degeneração neural. Curiosamente, embora a mitocôndria regule o destino das NSCs e o secretoma de todos os tipos celulares, os mecanismos metabólicos subjacentes ao potencial regenerativo do secretoma das NSCs ainda não estão totalmente esclarecidos. Neste trabalho pretendemos explorar o padrão metabólico mitocondrial das NSCs produtores de um secretoma protector, utilizando diferentes modelos de stress em NSCs. Além disso, o nosso objetivo foi, também, testar a influência de reguladores metabólicos (mitochondrial boosters) neste secretoma. Inicialmente, foram utilizadas NSCs em diferenciação tratadas com peróxido de hidrogénio (H2O2), como um modelo de células alvo e stress oxidativo. Os nossos resultados mostraram que as NSCs expostas a sinas de lesão (boosted NSCs) adquirem um fenótipo mais proliferativo, exibem maior fragmentação mitocondrial e diminuem a expressão de certas proteínas associadas à respiração e fosforilação oxidativa (OxPhos) e o número de cópias de DNA mitocondrial (mtDNA). O secretoma derivado das boosted NSCs, por sua vez, induziu um aumento do número de cópias de mtDNA nas NSCs alvo. Curiosamente, vários mitochondrial boosters, incluindo um cocktail de fatores neurotróficos que mimetiza algumas condições mediadas pelo exercício in vitro, foram também capazes de melhorar as propriedades terapêuticas do secretoma das NSCs (mitCM), uma vez que preveniram a morte celular induzida por H2O2 nas células alvo. Uma caracterização molecular mais profunda das NSCs produtoras de mitCM demonstrou que o aumento da fissão mitocondrial também estava presente nestas células, mas, neste contexto, encontrava-se associado a um aumento do número de cópias de mtDNA. No que diz respeito ao efeito dos mitochondrial boosters nas proteínas associadas a OxPhos, observámos um aumento significativo de várias proteínas associadas não relacionadas com a produção de ATP. Curiosamente, de acordo com o previamente observado no boostedCM, o mitCM também induziu um aumento do número de cópias de mtDNA nas NCS alvo. Finalmente, para compreender melhor o papel do metabolismo das NSCs na sua plasticidade in vivo, as NSCs foram estimuladas com soro proveniente de ratinhos deprimidos, utilizando um modelo animal de stress crónico e imprevisível ligeiro (uCMS), e o seu secretoma testado in vitro em céulas alvo em stress oxidativo. Estas NSCs foram denominadas de uCMS-boosted NSCs e o seu secretoma de uCMS boosted-CM. Surpreendentemente, os nossos resultados demonstraram que as propriedades neuroprotectoras do uCMS boosted-CM eram mais elevadas, quando comparado com o CM proveniente de NSCs estimuladas com soro derivado de ratinhos saudáveis. De realçar que, a caracterização metabólica das uCMS-boosted NSCs revelou que estas células sofreram também várias alterações metabólicas quando comparadas com as NSCs estimuladas com soro derivado de ratos saudáveis, exibindo um fenótipo mais proliferativo e um aumento da fissão mitocondrial e da sua biogénese. Concomitantemente, o soro de ratinhos deprimidos induziu a diferenciação de NSCs, que por sua vez, pareceu estar associada a elevadas as taxas de oxidação de ácidos gordos e OxPhos para a produção de energia. Coletivamente, estes dados demonstram que NSC expostas a sinais externos de lesão ou de reforço metabólico sofrem alterações metabólicas profundas que acompanham a produção de um secretoma neuroprotector para células lesadas em processo de diferenciação.

Skeletal muscle is essential in voluntary movement and other major vital functions. Muscle injuries are important in clinical practice and, despite skeletal muscle's good regenerative ability, severe tissue loss impairs complete myofibre regeneration, limiting structural and functional recovery of the affected muscle, eventually leading to the development of non-contractile fibrous scar. The intrinsic healing mechanisms rely in great extent on the residing progenitor population but significant drawbacks to their practical application in regenerative strategies boosted the search for alternative cell sources, such as extra-fetal mesenchymal stem cells (MSCs). MSCs have demonstrated to positively influence the regeneration of different disease models. When severe volumetric muscle tissue loss occurs, the body is seldom capable of replacing the lost portions with fully functional tissue. A rational strategy to aid the healing of such situations is the application of biomaterial implants that provide a structural matrix for the ingrowth of regenerating muscle fibres. Both synthetic and natural biomaterials have been hypothesized for this purpose and some have reached as far clinical cases applications. Obvious improvements are observed in most cases, but reaction to some biomaterials and functional recovery are still a challenge. The addition of MSCs to the biomaterials seems to improve the systems' performance in the overall regenerative milieu. This strategies promote scaffold's vascularization and integration, as well as accelerated tissue ingrowth and reduces scar formation, resulting in improved recovery rates at both structural and functional levels.

Cardiac diseases and cancer are the leading causes of death worldwide and can often coexist. Moreover, cardiovascular illnesses and cancer share common risk factors, creating a pathophysiological link between them. Endothelial cells (ECs), among the most abundant cell types in the heart, can be impacted by cancer secreted factors, as those cells can sense and respond to the OS secretome. However, OS-secretome influence in the heart endothelium is poorly described. In addition, and, due to doxorubicin (DOX) systemic administration, ECs are the first cells that contact with this drug, which correlates with acute and chronic cardiotoxicity. This study aims to investigate the impact of secretome derived from OS cells, either treated or untreated with DOX. Our main goal is to uncover the potential role of cancer cell-derived factors in inducing vascular stress, which may contribute to the development of cardiovascular diseases. To achieve this, we evaluated endothelial cell viability, tight-junction protein Zonula Occludens (ZO)-1 levels and distribution, angiogenic response, autophagic activity, and mechanisms driving cellular senescence.Mouse Cardiac Endothelial Cell (MCEC) line were incubated with the secretome of basal or DOX-treated OS cells (143B cell line) in an optimized proportion of OS-secretome and culture medium, that proved to not influence MCEC morphology. MCEC angiogenesis capacity was studied considering several parameters: cell migration was studied by a Scratch assay, MCEC proliferation was assessed by a KI-67-based proliferation assay (immunofluorescence), MCEC metabolic activity (viability) measurements were performed based on the reduction of resazurin and tube-like formation was measured by a Matrigel angiogenesis assay (tubulation assay). Tight-junction protein Zonula Occludens (ZO)-1 and γ-H2Ax foci were studied through immunofluorescence. Senescence (p53 and p21) and autophagy-related (p62, LC3-I, and LC3-II) proteins were studied by Western-Blot. TEM imaging was performed to visualize any ultrastructural differences regarding secretome-treated MCECs.Our data showed that osteosarcoma (OS)-derived secretomes decreased MCEC cellular viability and caused a significant reduction in MCEC proliferation capabilities. However, the incubation with both basal and doxorubicin (DOX)-treated secretomes was able to increase vessel-like structure formation. Furthermore, OS-derived secretomes induced marked alterations in ZO-1 protein subcellular distribution and levels, illustrated by internalized ZO-1 puncta and decreased total levels. OS secretomes also triggered cellular hypertrophy which can be correlated with other senescence-associated markers like an increase in γ- H2Ax foci and dysregulation of p53 and p21 protein levels. Additionally, OS-secretomes promoted a downregulation of p62 expression, while maintaining the ratio between LC3-II/LC3-I forms. Lastly, we also observed that OS-derived secretomes promoted alterations in ECs morphology such as organelle enlargement and had differences in their ultrastructure: mitochondria cristae and Golgi apparatus were enlarged, endoplasmic reticulum was deformed and the intercellular junctions presented some fissures.Our work elucidates on the direct interactions between osteosarcoma, its secretome and the dysfunctional behavior seen in MCECs. On top of that, our work demonstrated that OS-derived secretome might lead to senescence through a p53-independent mechanism. Moreover, our work represents a step forward towards new antitumoral therapeutic approaches that account for patients´ heart condition.

Introdução: O osteossarcoma (OS) é um tumor primário maligno que usualmente metastiza para o pulmão. Evidências crescentes sugerem que o tumor primário promove alterações fenotípicas nos fibroblastos pulmonares residentes, formando um nicho pré-metastático que favorece a colonização e desenvolvimento de metástases pulmonares. Posto isto, avaliámos a modulação do microambiente pulmonar e os efeitos recíprocos dos fibroblastos ativados sobre as células tumorais antes da colonização do pulmão. Materiais e métodos: Os pulmões foram recolhidos de murganhos não tratados, tratados com o secretoma das células 143B e de murganhos que possuíam um tumor primário subcutâneo. A modulação das proteínas da matriz extracelular (ECM), colagénio I/III e fibronectina foram avaliadas por imunohistoquímica e por western blot. Os fibroblastos pulmonares foram isolados a partir das três diferentes condições e avaliada a expressão de marcadores de ativação (α-SMA, vimentina e fibronectina) por imunocitoquímica e western blot. A capacidade de migração dos fibroblastos pulmonares também foi avaliada por um ensaio de scratch. A expressão de citocinas inflamatórias foi avaliada por qRT-PCR tanto no tecido como nos fibroblastos pulmonares. Depois desta caracterização, as células 143B foram expostas ao secretoma dos fibroblastos normais (NFs), e dos fibroblastos ativados derivados de murganhos tratados com o secretoma das células 143B (NAFsSCR) e derivados de animais com um tumor primário (NAFsSCT) em diferentes tempos de incubação. A quimiosensibilidade destas células à doxorubicina foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico com resazurina, assim como, características estaminais analisadas por um ensaio de formação de esferas e a expressão de genes de pluripotência e genes alvo da via de sinalização Wnt por qRT-PCR. A indução do estado de dormência foi avaliada por western blot. A adesão das células tumorais à fibronectina foi analisada na presença e na ausência de um anticorpo neutralizador da integrina β1. Resultados: O tecido pulmonar recolhido dos dois modelos animais tratados mostrou um aumento na deposição de fibras de reticulina (colagénio I/III) e fibronectina, e os fibroblastos pulmonares expressaram α-SMA, vimentina e fibronectina, bem como, um aumento significativo de mediadores inflamatórios, sugerindo um estado de ativação. As células 143B tornaram-se mais resistentes à doxorubicina, após serem expostas ao secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT, e adquirem propriedades estaminais, nomeadamente uma elevada expressão de SOX2 e KLF4, bem como, um aumento na eficiência de formação de esferas e no seu diâmetro. Às 24h de incubação, as células 143B entraram num estado de dormência, mostrado pela elevada expressão de p-p38 e diminuta expressão da pERK, representado por um rácio que muda progressivamente para o seu inverso, promovendo um fenótipo proliferativo. O secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT também estimula a adesão das células tumorais à fibronectina, sendo esta ligação mediada pela integrina β1. Conclusões: As células 143B, através da secreção de biomoléculas, induzem alterações no parênquima pulmonar e promovem a ativação dos fibroblastos, que têm efeitos recíprocos nas células tumorais, favorecendo a sua resistência à quimioterapia, entrada num estado de dormência antes de iniciarem a sua proliferação e aumentam as suas propriedades de adesão. Estes resultados evidenciam a interação mútua entre os fibroblastos e as células tumorais antes do início da colonização do pulmão. Adicionalmente, alguns destes mecanismos mediados pelos fibroblastos podem representar potenciais alvos para prevenir a formação de metástases pulmonares.

Introdução: O desenvolvimento de metástases pulmonares é atualmente a principal causa de morte nos doentes com osteossarcoma (OS). As abordagens terapêuticas atualmente disponíveis para o tratamento da doença metastática são pouco eficazes, sendo urgente a identificação de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de novos fármacos. A falta de modelos animais que mimetizem de forma fiel o desenvolvimento da doença metastática tem contribuído para os poucos avanços no tratamento de OS metastizado. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de modelos de metástases pulmonares de OS em murganhos, capazes de recapitularem as diferentes etapas da cascata metastática e com potencial de aplicação em investigação pré-clínica. Materiais e Métodos: Foram utlizados murganhos da estirpe Swiss nu/nu e uma linha celular humana de OS (143B) transduzida com o gene repórter da luciferase. Na indução de metástases pulmonares foram utilizadas duas abordagens: o modelo de metastização experimental e o modelo de metastização espontânea. O primeiro foi induzido através da injeção intravenosa das células tumorais na veia lateral da cauda. Dentre estes, um grupo de animais foi sujeito a um pré-tratamento com o secretoma das células tumorais antes da injeção das células na veia lateral da cauda. No modelo de metastização espontânea, foi induzido um tumor primário por injeção subcutânea das células tumorais. O tumor foi removido cirurgicamente e os animais foram mantidos em observação até ao aparecimento das lesões. A formação de metástases pulmonares foi monitorizada semanalmente por imagiologia ótica de bioluminescência até um máximo de 8 semanas. Após a necrópsia, as lesões pulmonares foram recolhidas para caraterização histopatológica. Resultados: No grupo de animais inoculados com as células tumorais na veia lateral da cauda, apenas 50% desenvolveram metástases pulmonares unilobulares. O pré-tratamento com o secretoma promoveu a formação de metástases em todos os animais e mais precocemente, tendo evoluído na sua maioria para múltiplas metástases. No modelo espontâneo, apenas um terço desenvolveu metástases pulmonares após a remoção do tumor primário. As lesões pulmonares apresentaram um padrão histopatológico semelhante, com áreas de necrose central e deposição de alfa-SMA nos septos alveolares peritumorais. Conclusões: O secretoma das células tumorais contém moléculas bioativas que favorecem a colonização e subsequente proliferação das células tumorais no parênquima pulmonar, destacando a importância do nicho pré-metastático na formação de metástases. O modelo de metastização espontânea confirmou o tropismo das células de OS para o pulmão. Apesar de melhor reproduzir todas as etapas da cascata metastática, a eficiência de formação é baixa.