Circuit modeling of scaffolds based on porcine adipose decellularized extracellular matrix (adECM) doped with reduced graphene oxide (rGO) for spinal cord regeneration is presented. The characteristics of the scaffolds capped with silver electrodes were studied in an aqueous medium through transient and AC analyses. In addition, cyclic voltammetry (CV) plots were obtained. The transient measurements were done using a custom current driver while the CV and AC measurements were obtained with an external impedance analyzer. The results revealed that incorporating rGO reduced the series resistance and the impedance at low frequencies of the scaffold.

Bone tissue can regenerate over the years, however, after a certain point, the rate of regeneration becomes lower than the rate of deterioration, resulting in loss of this tissue. This fact causes the tissue to become increasingly fragile, as well as certain diseases such as osteoarthritis, osteoporosis, which cannot be cured. However, the area of biomedical engineering has been developing scaffolds that can be implanted in the damaged location, enhancing the regeneration of bone tissue. In this work, scaffolds using biopolymers were developed, due to their biocompatibility and biodegradability. Piezoelectricity has demonstrated potential in this area, as it can enhance the growth and regeneration of bone tissue. However, despite the research about porous structures and their piezoelectricity, there is still a long way to go. Therefore, the main objective of this work was to create porous structures, consisting of two biopolymers with piezoelectric response and with mechanical and biological properties like those of bone tissue. The biopolymers chosen were chitosan (CS) and silk fibroin (SF), the latter is described in the literature as having a good electromechanical response. With this objective, porous structures of chitosan and silk were created with ratios 1:1 [CS/SF (1:1)] and 2:8 [CS/SF (2:8)], in terms of mass, using the ice templating process. In addition, structures with just one of the polymers were also prepared for better comparison. Through SEM analysis, it was found that CS had greater interconnectivity between pores than SF, resulting in greater interconnectivity in the mixture that had more CS. All samples, in general, had a heterogeneous structure, with pores of sizes between 100-300 μm, being higher for the sample containing only SF. The scaffolds presented high porosity, with values of 94.7%, 95.7%, 95.1% and 98.8% for CS, SF, CS/SF (1:1) and CS/SF (2:8), respectively. Through XRD analysis, it was noticed that polymers can interact with each other, presenting also the characteristic bands of the polymers that constitute them. FTIR allowed to confirm that combination of the two biopolymers created a peak at 1075 cm ˉ¹, which did not exist in samples with just one of the polymers, indicating their interaction. The cell viability of all samples was also tested, through MG-63 lineage, showing results above 70%, indicating that they are non-toxic to bone tissue. Furthermore, the swelling test showed values of 852%, 1196%, 837% and 1515% for CS, SF, CS/SF (1:1) and CS/SF (2 :8), respectively. When testing mechanical properties, SF and CS/SF (2:8) samples exhibited lower values, due to the random coils and α-helix chains being the most dominant silk structure, which confers a lower capacity to sustain loadings. The piezoelectric properties were tested and did not show adequate values to trigger the piezoelectric effect present in the bone for its regeneration. Through this research, it was realized that these materials interact well with each other, with high interconnectivity, are non-toxic to the organism and have high porosity, proving their potential for future studies.

Bone is a key structure in the human body, essential for support and many other functions. Unfortunately, various bone diseases that reduce bone density can lead to fractures and mobility issues. This has led to growing research in bone regeneration, focusing on the development of scaffolds, temporary artificial three-dimensional biomaterial structures that provide a specific environment and architecture for bone growth and development. Natural polymers like chitosan have similar properties to the organic components of bone extracellular matrix, with exceptional properties including biodegradability, non-toxicity, antimicrobial, nonimmunogenic, mucoadhesive, ease of modification, and osteoconductivity. Hydroxyapatite is one of the main components of the bone matrix, being a biodegradable material, biocompatible, non-toxic, non-immunogenic agent, osteoconductive, and has a high specific surface area. And cork, due to its unique 3D structure, is a promising material to be used as template agent for bone scaffolds. Chitosan/hydroxyapatite composites are well-studied for bone regeneration, while cork biochar combined with natural polymers and calcium phosphates shows promise for biomedical applications but remains in early research stages. Given that, this work focused on developing a new scaffold for bone tissue engineering combining cork-derived hydroxyapatite filler with chitosan prepared by freeze-drying. Cork pyrolyzed at 500 °C was successfully converted to calcium carbonate using calcium acetate impregnation. The best results obtained from the optimization of hydroxyapatite synthesis using commercial reagents using the precipitation method at 100 °C for 16 h, producing a mixture of 53% hydroxyapatite and 47% calcium carbonate, confirmed by X-ray diffraction analysis. Using the same conditions (100 °C, 16 h), cork-derived hydroxyapatite was also obtained from cork-derived calcium carbonate. Five porous structures were prepared: one with 2.5% (m/v) chitosan and four others with different fillers, including cork-derived calcium carbonate, cork-derived hydroxyapatite, optimized HA, and a mix of commercial HA with cork-derived calcium carbonate. Overall, the scaffolds presented interconnected pores ranging from 100 to 700 μm, with some around 2000 μm. Cork-derived hydroxyapatite scaffolds had the highest proportion of pores under 100 μm. They also presented high porosities between 88 and 98%, swelling capacities over 600% suggesting hydrophilicity, and biocompatibilities above 85%. However, the mechanical properties were well below real bone capacity, with compressive modulus between 0.58 and 2.18 MPa and compressive strengths in the range of 0.09-0.19 MPa, where the material with cork-derived hydroxyapatite presented the highest mechanical properties, doubling the values of the material composed of just chitosan, The cork-derived hydroxyapatite construct showed favorable properties to bone tissue engineering compared to the chitosan material, while exhibiting significantly better mechanical properties and maintaining strong cell viability. These promising results open new avenues for further exploration of potential applications for these materials.

Parametric design operates as an indispensable mechanism for the fabrication of elaborate geometries. In recent years, there has been an increase in the incidence of injuries to the spine and spinal cord. The most common causes of spinal cord injuries are traffic accidents, falls, high-impact sports, and acts of violence. The objective of this work was to graphically develop braided textile structures suitable for assisting in the treatment of spinal cord injuries. They were selected by criteria of number of layer yarns (internal and external), angle, structural diameter, and porosity. Thus, the structures have an internal layer with 8 yarns and an external layer with 8 or 16 yarns. The main requirement to select them is porosity of structure, and two main structures with different morphologies were simulated, followed by their characterization. The internal layer demonstrated a porosity of 84.77%, indicating feasibility for implementation. The external layer, one with 8 yarns, presented 82.14% porosity, similar to the previous sample, while the other with 16 yarns showed 66.03%. Both options exhibited clear distinctions: a conclusive framework comprising 8 strands in each layer manifested increased porosity, potentially compromising mechanical resilience. Conversely, a setup featuring 8 yarns in the internal layer and 16 in the external layer may confer enhanced mechanical attributes without compromising porosity. The utilization of Rhinoceros 3D software in collaboration with the Grasshopper plugin streamlined the morphological assessment process, facilitating the discernment of critical features prior to physical fabrication.

Vários tratamentos clínicos foram propostos em resposta a lesões e patologias ósseas. A sua aplicação poderá abarcar, no entanto, efeitos secundários importantes. Posto isto, nos últimos anos a comunidade científica tem empreendido grandes esforços no plano da Engenharia de Tecido Ósseo, área que se dedica ao estudo da aplicação de scaffolds, matrizes porosas capazes de promover a remodelação óssea. Este documento insere-se neste âmbito, narrando a fabricação, a caracterização física, química, topográfica e mecânica e a simulação de scaffolds híbridos produzidos por eletrofiação. Para isto, recorreu-se a uma solução híbrida, onde se combinou a policaprolactona e o vidro 58S (sistema SiO2 – CaO – P2O5) numa proporção mássica 60/40, respetivamente. Foi ainda investigada a adição de elementos dopantes, estrôncio, ferro e magnésio, bem como dois tempos de maturação da solução cerâmica, 7 e 14 dias. A adição de elementos dopantes trouxe benefícios inequívocos no que concerne às propriedades à compressão dos scaffolds 2D. Pelo contrário, apesar de ser evidente a influência do tempo de maturação nos parâmetros analisados, não foi possível chegar a conclusões do seu efeito concreto. Posto isto, as várias análises realizadas permitiram concluir a superioridade da solução híbrida dopada com magnésio e cuja solução cerâmica foi submetida a 7 dias de maturação, a solução P58S5A. As amostras obtidas após a eletrofiação desta solução revelaram uma percentagem satisfatória de diâmetros de fibras compatíveis com as fibras de colagénio do tecido ósseo. Por outro lado, foi um dos scaffolds que apresentou propriedades mecânicas mais aproximadas do osso. Assim sendo, seguiu-se o fabrico de scaffolds 3D de duas arquiteturas distintas com este material: Arquitetura 1 (disposição 0º/90º) e Arquitetura 2 (disposição 0º/45º/90º). Os ensaios de compressão experimentais revelaram um módulo de Young superior nos scaffolds de arquitetura 1, o qual deverá promover a adesão e a migração celular. Situação inversa foi verificada nos ensaios de compressão computacionais, o que é consequência das diferenças geométricas entre os scaffolds fabricados e os seus modelos computacionais. A simulação estática permitiu ainda constatar deformações principais máximas superiores no modelo de arquitetura 1. Com base nisto, é pertinente concluir que as estruturas fabricadas poderão representar, de facto, uma solução viável no âmbito da Engenharia de Tecido Ósseo e são, portanto, merecedoras de uma investigação mais ampla e aprofundada.

Hard-to-heal ulcers are serious life-threatening chronical conditions, impairing skin and mucosa full regeneration and opening the door to debris or severe infections. The cost of treatment also puts national health systems across the globe under pressure. Several products aiming at skin wound healing exist on the market, giving the surgeon different options to choose from when tackling this condition, but there is still the need to develop better solutions in treating different clinical cases, not to mention aesthetical results. Chitosan, originated from the outer skeleton of shrimp and shellfish, is a natural polymer that has been extensively described in the literature, with applications in tissue engineering, drug delivery or vaccine immunogenicity. Being biocompatible and with low toxicity, several biomedical devices have been tested, including nanoparticles, biofilms or nanofibers. Among them, nanofibers reveal an extraordinary similarity to the collagen fibers comprising extracellular matrix, a network that confers nutrient and mechanical support to embedding cells and promotes the formation of new tissue, vital when pursuing skin regeneration. Chitosan fibers can be fabricated by spinning processes, including the widely reported Electrospinning, taking use of electrical fields, or Solution Blow Spinning (SBS), which uses instead heat and solvent evaporation to produce fibers. In the present work, chitosan was spun by SBS to produce scaffolds that can be used in skin wound healing. Due to chitosan chemical nature, spinning with a co-polymer – Polyethylene Oxide (PEO) - was required. The first goal was to develop a three-layered scaffold with different weight ratios of Chitosan and PEO, and a neutralization step in a basic solution revealed promising in extracting PEO. The layer with the highest chitosan content from the scaffold was further functionalized with bioactive molecules, tannic acid and growth factor cocktail-Platelet Lysate, to grant enhanced biological properties. Infrared spectroscopy and Scanning Electron Microscopy revealed the successful interaction between chitosan and the mentioned molecules, with stress-strain testing assuming crucial to analyse variations in mechanical properties. Lastly, the fabricated fibers were subjected to preliminary in vitro testing with Normal Human Dermal Fibroblasts, showing their attachment and proliferation, on what can be seen as a promising step to further characterize the single layered and three-layered scaffolds.

Piezoelectricity has been recognised as a crucial regulator of essential bone metabolic activities, including growth, remodelling, and defect repair. The intrinsic electrophysiological properties of bone are oftentimes overlooked when designing scaffolds to regenerate this tissue. Some metallic oxides with a perovskite structure, like barium titanate, have outstanding piezoelectric performance and can be used to stimulate bone regeneration by being implemented in a flexible polymeric composite. Nonetheless, due to the much lower dielectric constant of the polymer, in comparison to the ceramic, a conductive filler is added to the ceramic to ensure the correct polarization of the barium titanate particles. Conducive carbon nanoparticles can be used to correct the dielectric differences, although the insufficient contact between the piezoelectric component cannot be rectified. Thereby the implementation of recently designed highly porous three-dimensional graphite foams can be a viable opportunity to have electroactive bone regeneration, incorporating an innovative nanostructure composed of a three-dimensional graphite foam with barium titanate nanoparticles in a chitosan/nanohydroxyapatite supportive structure prepared by freeze-drying. Barium titanate nanoparticles with high tetragonality (~99%) were successfully synthesised through hydrothermal synthesis at mild temperatures (200 °C). The effect of the reaction time and synthesis method was characterised by X-ray diffraction, Raman spectroscopy and Scanning electron microscopy. Dispersions of these particles were done in water and evaluated with zeta potential. The impregnation of these dispersions onto the three-dimensional graphite foam was done via voltage-assistance, which improved impregnation flux, as seen in the micrographs. This method was further characterised by X-ray diffraction and Atomic Force Microscopy. The construct was then fitted into a porous chitosan structure and prepared through freeze-drying to act as a scaffold for bone regeneration. The characterization of the chitosan-based scaffolds with and without nanohydroxyapatite found good porosity (~80-90%), tuneable mechanical properties, biomineralization, degradation profile and good cell viability. Piezoresponse tests were done at local (d₃₃ = 12 pC/V) and macroscale (d₃₃ = ~5 pC/N) with piezoresponse force microscopy and a d₃₃-meter, respectively. Voltage and current were also measured at the macroscale. The new design developed for piezoelectric bone scaffolds reveals a promising perspective for the active regeneration of bone tissue.

O transplante de pele é de extrema importância para os pacientes que sofrem de perda severa de pele. Globalmente, o número de incidentes de queimaduras severas ao ponto de necessitar de tratamentos médicos ultrapassa o número de incidentes de tuberculose e VIH combinados. O transplante de pele por autoenxerto consiste em transferir pele de uma secção de uma área do corpo para outra, e apesar de suas limitações (necessidade de um procedimento cirúrgico adicional, disponibilidade limitada, e dor do local de extração), representa um método versátil e dinâmico de reconstrução cutânea, e continua a ser o tratamento padrão para lesões graves de pele. Embora tenham sido desenvolvidos e comercializados tratamentos regenerativos competentes, estes ainda apresentam limitações anatómicas, funcionais e estéticas. Esta dissertação está envolvida no desenvolvimento da camada dérmica de um substituto biossintético da pele: Skin2, mais concretamente, estudando a interação entre materiais candidatos a constituir este substituto dérmico com as células do sistema imunitário, nomeadamente a diferenciação destas células em contacto com os materiais e a degradação destes materiais por parte destas células. Os monócitos são células do sistema imunitário que se diferenciam em macrófagos aquando do contacto com agentes patogénicos. Estes dois tipos de células estão entre as primeiras linhas de defesa contra corpos estranhos ao organismo, e desempenham um papel crucial na natureza da sua resposta a estes corpos estranhos, podendo induzir uma resposta inflamatória ou regenerativa. Sendo um enxerto de uma camada dérmica considerado um corpo estranho ao organismo, torna-se relevante estudar as interações entre os materiais candidatos a formar esta camada dérmica, e as células que determinam a natureza da resposta a estes materiais. O objetivo desta tese foi estudar as interações entre macrófagos diferenciados a partir de monócitos (THP-1) e scaffolds celulares produzidos em laboratório por eletrofiação, nomeadamente: Viabilidade da linha celular monocítica THP-1, tal como a sua diferenciação em macrófagos e a polarização dos mesmos em fenótipo inflamatório ou regenerativo (M1 ou M2, respectivamente), quando em scaffolds produzidos com diferentes materiais e misturas desses materiais; Diferenças morfológicas dos macrófagos nos scaffolds, com diferentes materiais; A erosão gerada pelos macrófagos nos scaffolds. Os materiais usados na eletrofiação foram dois polímeros de origem natural – Gelatina de pele de peixe de água fria (GEL), e Quitosano (CS) – e um polímero de origem sintética – poli-ε-caprolactona (PCL) – sendo cada um dos materiais usado individualmente ou sendo os materiais misturados entre si em misturas binárias ou ternárias. Os scaffolds produzidos foram depois reticulados com glutaraldeído (GTA) se tivessem CS ou GEL, de forma a manter as suas propriedades físicas, e cada um deles foi mais tarde semeado com células THP-1, em duas condições: com e sem adição de forbol-12-miristato-13- acetato (PMA), que induz a diferenciação de monócitos em macrófagos. Numa primeira fase de cultura, foi semeada uma réplica de cada condição (cada scaffold e controlos com e sem PMA) por sementeira, e foi verificada a viabilidade celular em cada material ao fim de 48 horas através do teste de resazurina. Estas sementeiras foram repetidas várias vezes, com a perspetiva de obter coerência de resultados com repetição do mesmo procedimento, solidificando quaisquer conclusões que pudessem ser retiradas dos mesmos. No entanto, esta coerência de resultados não se verificou, tendo-se verificado uma grande variabilidade nas viabilidades celulares para os mesmos materiais em sementeiras diferentes. Devido ao facto de se terem gasto todos os materiais produzidos por eletrofiação nesta primeira fase, foi tentado um outro método de produção de materiais, teoricamente mais fácil e mais rápido: produção de filmes por evaporação de solvente. Os filmes a serem produzidos teriam, idealmente, a mesma composição química que os scaffolds de PCL, apenas alterando a morfologia em que os polímeros estavam dispostos. No entanto, a produção destes filmes tornou-se um desafio maior do que o previsto, tendo em conta que os filmes que continham PCL apresentavam uma clara separação de fases devido à imiscibilidade dos polímeros, o que fez com que fossem adicionados alguns compostos às soluções, como o Poly(óxido de etileno), visando torná-las mais viscosas, de forma a atenuar esta separação de fases, homogeneizando o filme. Esta tentativa de homogeneização não teve sucesso, pelo que a produção de filmes poliméricos foi abandonada e os materiais voltaram a ser produzidos por eletrofiação. Foram ainda medidas as quantidades de endotoxinas em soluções poliméricas com os materiais utilizados em electrofiação, de forma a verificar quais destes continham valores de endotoxinas acima do limite médico (0,5 unidades de endotoxina por mililitro – EU/mL). Foi verificado que apenas a solução de GEL se encontrava acima deste limite, com 1,1 UE/mL na solução de concentração 1% (m/m) e com 1,5 EU/mL na solução de concentração 2%, enquanto as soluções de PCL e CS se encontravam dentro dos limites médicos, com a mesma concentração de 0,065 UE/mL. As endotoxinas foram removidas de GEL de duas formas: adição de peróxido de hidrogénio a uma solução de GEL que viria mais tarde a ser eletrofiada, e através do tratamento desidrotérmico (DHT) após a deposição da matriz por electrofiação. No entanto, a remoção das endotoxinas com a adição de peróxido de hidrogénio impossibilitou a subsequente eletrofiação do material para produção do scaffold. Seguiu-se então uma segunda fase de cultura, que passou a ser feita de acordo com um novo procedimento, sendo semeadas em cada sementeira 5 réplicas do mesmo material com PMA e 5 réplicas sem PMA, bem como controlos com e sem PMA, e sendo adicionado à cultura o material GEL com tratamento DHT. Após 48 horas, as células não aderidas foram retiradas dos poços e contadas, e foi feito o teste de resazurina com as células aderentes. Após este teste, foi adicionado meio de cultura aos poços, e o teste voltou a ser feito passadas 120 horas, de forma a verificar se a viabilidade se mantém ao longo do tempo. Os novos resultados de viabilidade mostram que todos os materiais são viáveis, sendo que no scaffold de GEL que realizou tratamento desidrotérmico e no scaffold de PCL, há um aumento da viabilidade celular das 48 para 120 horas de cultura, sugerindo uma viabilidade prolongada nestes materiais, em contraste com os restantes, que apresentaram uma ligeira descida. Além disso, a estimativa das taxas de adesão mostra que scaffolds com misturas de polímeros tendem a promover maior adesão celular do que os scaffolds unitários. Numa última fase, foi realizada microscopia de fluorescência com a finalidade de observar diferenças na morfologia celular dos macrófagos nos diferentes materiais, bem como na sua distribuição ao longo dos mesmos ao fim de 48 e 120 horas de cultura. No entanto, devido à elevada autofluorescência dos scaffolds de CS e de GEL no comprimento de onda de 555 nm (vermelho), a aquisição de imagens foi dificultada, bem como o seu tratamento. Apesar de ter sido possível obter imagens de microscopia de fluorescência, não são percetíveis quaisquer alterações morfológicas entre as células nos diferentes materiais. Em relação à erosão gerada por macrófagos nos scaffolds, não foi observada qualquer degradação em microscopia eletrónica de varrimento (SEM). No entanto, os resultados do SEM possibilitaram uma observação mais clara da morfologia dos macrófagos e permitiram estimar o seu fenótipo, de forma mais evidente do que com microscopia de fluorescência. A adição de PMA induz uma morfologia principalmente inflamatória (M1) nos macrófagos, com células arredondadas. Sem a adição de PMA, o fenótipo dominante aparenta ser o fenótipo inativado (M0) para os scaffolds unitários e para o scaffolds de CS GEL, e M1 para os scaffolds de CS PCL, GEL PCL, para a matriz ternária.