In this work, porous scaffolds obtained from the freeze-drying of pectin/chitosan polyelectrolyte complexes were prepared and characterized by FTIR, SEM and weight loss studies. Additionally, the cytotoxicity of the prepared scaffolds was evaluated in vitro, using human osteoblast cells. The results obtained showed that cells adhered to scaffolds and proliferated. The study also confirmed that the degradation by-products of pectin/chitosan scaffold are noncytotoxic.

O objetivo dessa pesquisa foi avaliar, in vitro, a influência de duas novas formulações de cimentos endodônticos: BC Sealer (Brasseler, Estados Unidos da América) e MTA Fillapex (Angelus, Brasil) e do cimento AH Plus (Dentsply, Alemanha) quanto a citotoxicidade em cultura de células humanas e o efeito desses no balanço RANKL/OPG. A partir de fragmentos ósseos descartados pós cirurgias ortopédicas em indivíduos saudáveis, osteoblastos humanos foram cultivados em laboratório e, após confluência, permaneceram expostos ao extratos dos cimentos endurecidos e logo após a manipulação por 24h. Um grupo exposto ao látex e um grupo de células expostas apenas ao meio de cultura serviram como controle positivo e negativo, respectivamente. Para avaliar os efeitos desses cimentos na viabilidade e morfologia de osteoblastos foram empregadas cinco metodologias: teste multiparamétrico para ensaio de citotoxicidade avaliando função mitocondrial (XTT), integridade da membrana (vermelho neutro) e proliferação celular (cristal violeta); teste IC50; microscopia eletrônica de varredura; microscopia de fluorescência para identificar células vitais e citometria de fluxo com a tecnologia do Luminex® utilizando dois painéis humanos que envolvem a osteoclastogênese. Após análises estatísticas, qualitativas e morfológicas, os resultados revelaram que, comparado aos controles, o cimento AH Plus foi citotóxico logo após a manipulação (p<0,05), mas semelhante ao controle negativo quando empregado após o endurecimento. O cimento MTA Fillapex foi citotóxico tanto fresco como após a presa, entretanto, na análise do índice de diluição (IC50), sua toxicidade foi diminuída a partir da média de 75% quando endurecido e logo após a manipulação. O cimento BC Sealer não apresentou toxicidade. Nenhum dos cimentos avaliados promoveu alteração na relação OPG/RANKL em relação ao controle negativo. Foi possível concluir que a sensibilidade dos testes utilizados para a citotoxicidade foi semelhante sendo que a nova formulação de cimento endodôntico biocerâmico, BC Sealer, foi o único grupo que, in vitro, não citotóxico. Os materiais testados não contribuíram para a osteoclastogênese

O defeito ósseo pode ter como causas: traumas faciais, atrofia óssea alveolar, reabsorção do osso alveolar, cânceres e tumores que levam a desconforto e alterações das funções. Vários materiais são propostos para a enxertia óssea, porém apresentam limitações quanto às propriedades requeridas para osteogênese. A reconstrução destes defeitos são um desafio para a engenharia tecidual. A indústria tem inovado, oferecendo biomateriais com mais de uma fase, visando combinar as propriedades dos diversos materiais para obter a osteocondução e a osteoindução, além de investir na nanotecnologia, que oferece biomateriais com características capazes de mimetizar a estrutura óssea. O objetivo deste estudo foi comparar um material xenogênico à base de hidroxiapatita (HA) micrométrica, com um biomaterial alogênico à base de HA e β-trifosfato de cálcio, nanométricos. Após criação de um defeito ósseo crítico, na calvária de ratos Wistar foram inseridos: xenomaterial no grupo BO, alogênico material no grupo REG e outro grupo controle (CTRL) sem inserção de material, apenas coágulo. Para avaliação geral das estruturas, foi realizada a coloração para HE. Além disso, foi realizada a coloração para Tricrômico de Goldner e imunomarcação para OPN para avaliação das áreas ossificadas e imunomarcação para VEGF para observar a formação de vasos sanguíneos. A coloração foi realizada para HE pelo método regressivo e para o Tricrômico de Goldner foram usados hematoxilina férrica de Weigert, corante Ponceau Acid Fuchsin, ácido fosfomolibdico orange G e solução light-green. Nas imunomarcações foram realizadas a recuperação antigênica. Na imunomarcação para OPN foi usado o anticorpo primário anti-Osteopontina (Santa Cruz, sc-21742), diluído em PBS/BSA a 1% (1:200) e para VEGF foi usado o anticorpo primário anti-VEGF (Santa Cruz, sc-1876), diluído em PBS/BSA a 1% (1:100), ambos, foram incubados com estreptavidina VECTASTAIN® Universal Quick HRP Kit). Os dados foram analisados usando o ANOVA one-way, seguido pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis (p < 0,05) e pós-teste de Dunn. O resultado da análise histológica com HE e Tricrômico de Goldner e imunomarcação para OPN e VEGF mostrou apenas fibras colágenas no grupo CTRL, enquanto no Grupo BO e REG observamos o biomaterial associado a tecido conjuntivo e áreas ossificadas. No grupo REG, a observação da marcação com OPN mostrou enclausuramento de células com características de osteoblastos em área com tecido recentemente ossificado. A análise histomorfométrica apresentou diferença estatística significante ao comparar o grupo REG e CTRL com OPN, VEGF e coloração por Tricrômico de Goldner. A média de áreas coradas com Tricômico de Goldner, OPN e VEGF foram expressivamente maiores no grupo REG. A conclusão foi que o biomaterial alogênico, com partículas nanométricas é perfeitamente adequado para utilização na reconstrução de tecidos ósseos; a produção de VEGF, que favorece a angiogênese, e da OPN, que indica ossificação, foi maior no grupo com biomaterial alogênico e a manutenção do coágulo, apenas, não favoreceu a osteogênese.

A hanseníase é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacteruim leprae, um bacilo intracelular obrigatório, que prolifera principalmente na pele e nos nervos periféricos no interior de células como macrófagos e células de Schwann. A transmissão ocorre por meio das mucosas das vias respiratórias, provavelmente por aerossóis expelidos por indivíduos infectados. O homem é o seu hospedeiro natural sendo a multiplicação do bacilo muito lenta, com um período de geração estimado de 14 dias. Apesar da mínima variação no genoma do M. leprae, a doença é caracterizada por um espectro de formas clínicas bem definido, decorrente da capacidade de resposta imune do hospedeiro. Em pacientes classificados como multibacilares (MB) a doença é disseminada, com inúmeras lesões de pele e proliferação bacilar considerável. Nesses indivíduos ocorre hiporresponsividade celular ao M. leprae. Nas formas paucibacilares (PB), os pacientes apresentam uma ou poucas lesões, a carga bacilar é pequena e, às vezes não observada por meio da baciloscopia tradicional e ocorre resposta imune patógeno-específica. As incapacidades físicas nos pacientes decorrem da neuropatia e osteopatia e podem ser irreversíveis. Essas deformidades podem avançar mesmo após a diminuição da carga bacilar com o final do tratamento poliquimioterápico. A presente tese teve por objetivo estudar as implicações da proteína PHEX nas alterações fisiopatológicas da hanseníase, em especial as alterações ósseas. A proteína PHEX (Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase on the X chromosome) é expressa em várias células humanas e, no primeiro artigo que compõe essa tese, demonstramos que o M.leprae leva à diminuição da expressão de PHEX em linhagens de células de Schwann e osteoblastos humanos. Este efeito foi igualmente causado por outras espécies de micobactérias. No segundo manuscrito ora submetido, observamos que em leucócitos sanguíneos de pacientes hansenianos também ocorreu modulação negativa de PHEX. Este efeito não se relacionou com a capacidade de produção de citocinas inflamatórias frente ao M. leprae in vitro ou com alterações bioquímicas. O efeito inibidor da mineralização ocasionado pela modulação negativa de PHEX talvez contribua para a doença óssea da hanseníase, auxiliando a explicar a capacidade do M. leprae de penetrar e sobreviver no osso.

In this study, the effects of geraniin on osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-κB ligand(OPG/ RANKL) in regulating the proliferation of osteoblasts and suppression of osteoclast-like cells (OLC) in OLC-osteoblast co-cultured system in vitro were investigated. Osteoblasts were cultured and identified with alkaline phosphatase (ALP), gomori stain, and mineralized nodule stain. OLCs were isolated from long bones of Sprague–Dawley (SD) rats and identified with tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) stain. Methyl thiazolyl tetrazolium assay was used to examine the proliferation of osteoblasts, and immunocytochemistry and in situ hybridization to analyze the expression OPG/RANKL in osteoblasts co-cultured with osteoclasts under the action of geraniin, respectively. Geraniin could regulate the proliferation of osteoblasts MC3T3-E1, decrease the number of OLC in OLC-osteoblast co-cultured system, and inhibit the bone resorption areas and resorption pits of OLC in vitro experiments. Geraniin could promote the mRNA and protein expression levels of OPG and suppress those of RANKL in osteoblasts. These results indicate that geraniin has a promoting effect on the proliferation of osteoblasts and an inhibitory effect on the osteoclastic bone-resorption through regulating OPG/RANKL signaling pathway in OLC-OB co-cultured system.

Heterogeneous cell populations of osteo/cementoblastic (O/C) or fibroblastic phenotypes constitute the periodontal dental ligament (PDL). A better understanding of these PDL cell subpopulations is essential to propose regenerative approaches based on a sound biological rationale. Objective: Our study aimed to clarify the differential transcriptome profile of PDL cells poised to differentiate into the O/C cell lineage. Methodology: To characterize periodontal-derived cells with distinct differentiation capacities, single-cell-derived clones were isolated from adult human PDL progenitor cells and their potential to differentiate into osteo/cementoblastic (O/C) phenotype (C-O clones) or fibroblastic phenotype (C-F clones) was assessed in vitro. The transcriptome profile of the clonal cell lines in standard medium cultivation was evaluated using next-generation sequencing technology (RNA-seq). Over 230 differentially expressed genes (DEG) were identified, in which C-O clones showed a higher number of upregulated genes (193) and 42 downregulated genes. Results: The upregulated genes were associated with the Cadherin and Wnt signaling pathways as well as annotated biological processes, including “anatomical structure development” and “cell adhesion.” Both transcriptome and RT-qPCR showed up-regulation of WNT2, WNT16, and WIF1 in C-O clones. Conclusions: This comprehensive transcriptomic assessment of human PDL progenitor cells revealed that expression of transcripts related to the biological process “anatomical structure development,” Cadherin signaling, and Wnt signaling can identify PDL cells with a higher potential to commit to the O/C phenotype. A better understanding of these pathways and their function in O/C differentiation will help to improve protocols for periodontal regenerative therapies.

The objective of the present study was to characterize bone cells grown in two culture media, and to determine the effective concentration of OP-1 on the growth of osteo-1 cells. Subcultured rat bone cells (osteo-1) were grown in alpha-modified Eagle's minimal essential medium (alpha-MEM) and Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) and total protein content, alkaline phosphatase activity and the formation of mineralized nodules were evaluated after 7, 14 and 21 days. Cells were exposed to different concentrations of rhOP-1 for 1, 3, 5 and 7 days and compared with an untreated control. Osteo-1 cells presented a significant increase in alkaline phosphatase activity and calcium deposits were observed at 21 days. Cells treated with 10 and 20 ng/mL rhOP-1 for 24 h showed a significant increase in cell viability when compared to control. Osteo-1 cells cultured on DMEM demonstrated an osteoblastic phenotype as indicated by high alkaline phosphatase activity and the presence of calcified nodules. The results suggest that low concentrations of OP-1 may promote an osteogenic effect on osteo-1 cells.

We have studied the effect of chitosan sponges, produced from chitosan batches with distinct degree of deacetylation (DDA) and molecular weight (Mw), on the adhesion, growth and differentiation of primary human osteoblasts with an aim to offer a suitable tool for guided bone regeneration. All the chitosan sponges revealed similar microstructure, irrespective of the DDA (58, 73, 82, 88, and 91 %) and Mw (749, 547, 263, 215, and 170 kDa, respectively). Cell spreading was higher on sponges having a higher DDA. Higher DDA induced a more pronounced increase in alkaline phosphatase activity, osteopontin (OPN), vascular endothelial growth factor-A (VEGF), interleukin-6 (IL-6), and reduction in monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), sclerostin (SOST) and dickkopf related protein-1 as compared to lower DDA. Lower DDA induced the increased secretion of osteoprotegerin and SOST as compared to higher DDA. The combination of higher DDA and Mw induced an increased secretion of VEGF and IL-6, however reduced the secretion of OPN as compared to chitosan with similar DDA but with lower Mw. In summary, the variations in cellular responses to the different chitosan sponges indicate a potential for individual tailoring of desired responses in guided bone regeneration.

Mycobacterial infections can lead to the loss of bone mass without direct colonization of the bone. Osteopenia arises from a dysregulation of the bone turnover, due to enhanced bone degradation and/or impaired new bone formation. The indirect bone loss during infection is due to the production of immune mediators by the host upon pathogen invasion. Previous studies using a murine model of M. avium disseminated infection indicated that bone mass was decreased in an IFNγ and TNFα-dependent manner, and that Saa3 was the gene whose expression in the bone increases the most with infection. Therefore, this thesis aims to further understand the molecular mechanisms of bone loss associated to chronic mycobacterial infection and dissect the role of the serum amyloid A3 protein (SAA3) in bone degradation and bone formation. Here, we show that M. avium-infected macrophages produce soluble pro-osteoclastogenic factors (SPOFs) that increase bone resorption by osteoclasts. We identified TNFα as a SPOF produced by infected macrophages and whose production is potentiated by IFNγ. Moreover, we assessed that SAA3 is another SPOF produced by M. avium-infected macrophages in vitro and TNFα enhances Saa3 expression in infected macrophages. Likewise, we determined that in vitro differentiated osteoclasts produce SAA3 upon TNFα stimulation. Furthermore, the SAA protein stimulates osteoclastogenesis, while not enhancing their resorptive activity. However, TNFα addition increases the proportion of trenches. We further found that the conditioned media from infected macrophages had no effect on the mineralization capacity of osteoblasts and that SAA diminished it, indicating that SAA impairs osteoblastic differentiation and activity. Overall, our results highlight a possible molecular mechanism for bone loss during chronic infection, in which IFNγ, TNFα, and SAA3 are the key molecules. M. avium infection leads to the production of IFNγ, which will instruct macrophages to produce SPOFs like TNFα and SAA3. Chronic infection will increase bone destruction, as SAA and TNFα enhance the formation and activity of osteoclasts, respectively. Simultaneously, SAA protein impairs osteoblastic differentiation and activity. Our results emphasize the role of SAA proteins, particularly the SAA3 protein, as key proteins in the bone turnover process during mycobacterial infection.

Two type of cells representing periodontal hard tissues (osteoblasts) and soft tissues (fibroblasts) were evaluated in response to microgroove-milled zirconia surfaces. A total of 90 zirconia discs were randomly assigned to four width-standardized milling microgroove-textured groups and a control group without grooves (UT). The sandblast and acid-etch protocol were applied to all samples. Both cell lines were cultured on zirconia discs from 1 day up to 14 days. Cell morphology and adhesion were evaluated after 1 day of culturing. Cell viability and proliferation of the cells were measured. Alkaline phosphatase activity, collagen I, osteopontin, interleukin 1β and interleukin 8 secretions were assessed at predefined times. The results obtained were presented in the form of bar graphs as means and standard deviations. Multi comparisons between groups were evaluated using two-away ANOVA or Mann-Whitney tests, and a p-value < 0.05 was established. Group comparisons with regard to cell viability, proliferation and secretion of collagen I, interleukin-1β and interleukin 8 revealed no statistically significant differences. The alkaline phosphatase activity and osteopontin secretion were significantly higher in the group with a large groove compared to the small one and the control group. Nevertheless, the viability of gingival and bone cells did not appear to be affected by the milled microgroove texture compared to the conventional sandblasted and acid-etched texture, but they seem to influence osteoblasts' cellular differentiation.