Este trabalho representa o meu relatório final para a conclusão do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas na Universidade da Beira Interior e está dividido em dois capítulos. O primeiro aborda a investigação laboratorial realizada no Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior, cujo objetivo foi desenvolver e caracterizar formulações lipossomais contendo um fármaco convencional, de baixo peso molecular e lipofílico, de ação neuroprotetora, com e sem DNA plasmídico, para aplicação terapêutica no contexto do Acidente Vascular Cerebral isquémico, privilegiando a via intranasal como estratégia de administração direcionada ao sistema nervoso central. Os lipossomas foram preparados com diferentes fases aquosas e proporções lipídicas, sendo caracterizados quanto ao tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta, encapsulação de DNA e estabilidade. Os resultados demonstraram que a preparação em tampão fosfato 10 mM pH 7,2 foi a condição mais promissora para formulações contendo DNA, enquanto a solução de NaCl 0,9% favoreceu a homogeneidade em formulações sem DNA. A presença do lípido catiónico (DOTAP) revelou-se essencial para a encapsulação de material genético, embora em elevadas proporções tenha comprometido a obtenção de lipossomas sem DNA homogéneos. O fármaco de baixo peso molecular até uma percentagem mássica de 15,4% não alterou significativamente as propriedades físico-químicas dos lipossomas com DNA, mas uma proporção mais elevada (20% m/m) levou à sua precipitação em lipossomas sem DNA passado alguns dias, não tendo o mesmo sido verificado na percentagem de 11,1% (m/m). Estes resultados confirmam o potencial dos lipossomas como sistema de encapsulação de um fármaco de interesse em neuroproteção, associado ou não a DNA plasmídico, tendo em vista a entrega de fármacos neuroprotetores em casos de AVC isquémico. No entanto, ainda são necessários mais estudos, de modo a melhorar a estabilidade e estudar a sua eficácia terapêutica. O segundo capítulo diz respeito à minha experiência profissionalizante na vertente de farmácia comunitária, cujo objetivo foi a aproximação à realidade da prática farmacêutica, através do contacto direto com os utentes e da resolução de casos clínicos reais. O estágio decorreu de fevereiro a junho de 2025, na Farmácia Gama Vieira em Tondela, sob a orientação da Dra. Fátima Vale. Durante este período, participei em diversas atividades da farmácia, nomeadamente a receção e conferência de encomendas, a dispensa de medicamentos, o aconselhamento farmacêutico e a preparação de medicamentos manipulados. Neste capítulo relatei a minha experiência, abordando temas como o funcionamento da farmácia, as atividades desempenhadas ao longo do estágio, bem como as diferentes experiências ao nível do aconselhamento farmacêutico. Este período proporcionou-me a oportunidade de integrar e aplicar os conhecimentos teóricos obtidos ao longo do curso à prática profissional, assim como aprimorar competências técnicas e humanas.

Ischemic stroke (IS) remains one of the leading causes of death and disability worldwide, representing a major clinical and economic challenge. It is caused by the temporary or permanent interruption of a blood vessel, leading to disruption of the central nervous system and consequent neuronal loss. In the acute phase, therapeutic strategies include thrombolysis and thrombectomy to restore blood flow, whereas in the chronic phase, approaches aimed at promoting neural plasticity, such as cell therapy, are employed. However, these techniques face several limitations, as their efficacy is directly influenced by multiple variables, making their response unpredictable. Recent studies have attributed the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) mainly to their paracrine action, thus positioning the use of their secretome as a promising alternative. In this work, we evaluated the impact of secretome derived from umbilical cord MSCs (UC-MSCs), obtained under normoxic and hypoxic conditions, on neuronal viability and on the recovery of synaptic structure after oxygen and glucose deprivation (OGD) in vitro. The results suggest that the secretome can modulate cell survival, preserve the length of neuronal arborization processes, and modulate synaptic markers. Although some results are promising, further studies are required to explore alternative approaches in order to better understand the action of MSC-derived secretome in the treatment of ischemic stroke and other neurological disorders associated with hypoxicischemic injury.

A Doença de Alzheimer (DA) causa déficits cognitivos e de memória, entre outros. O mecanismo de desenvolvimento da DA incluí processos inflamatórios e estresse oxidativo em virtude do acúmulo da proteína β-amilóide no cérebro. Por seu potencial antioxidante, chás provenientes da Camellia sinensis e o exercício físico são estratégias neuroprotetoras eficazes em diversos modelos de déficits cognitivos. No entanto, não está claro se tanto as variedades dos chás da Camellia sinensis quanto os diferentes tipos de exercício possuem o mesmo potencial neuroprotetor na DA. Adicionalmente, poucos estudos investigam estratégias de neuroproteção em modelos de DA associado a fatores de risco da doença, como uma dieta hipercalórica. Considerando esse contexto, determinamos o potencial neuroprotetor de diferentes chás provenientes da Camellia sinensis e de diferentes configurações de exercício físico em um modelo de DA associada ou não a dieta hipercalórica. Após a realização de uma série de experimentos bioquímicos e comportamentais, concluímos que (a) o chá verde tem maior potencial neuroprotetor no modelo de DA, (b) uma dieta hipercalórica associada ao modelo de DA não potencializa déficits cognitivos e dano oxidativo no hipocampo, e (c) o exercício de força possui potencial neuroprotetor no modelo de DA estudado e é a única estratégia que também atua no sistema colinérgico.

Estudos relacionados à investigação de propriedades biológicas de espécies vegetais têm contribuído para o combate de diversas patologias, através da obtenção de princípios ativos que apresentam propriedades farmacológicas e biotecnológicas. O estresse oxidativo causado pela aumentada produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, entre estes o H2O2 está envolvido em diversas doenças neurodegenerativas que tem impulsionado a busca por terapias antioxidantes. Plantas superiores apresentam altas concentrações de compostos com potencial antioxidante em sua composição, podendo apresentar metabólitos com importante potencial do ponto de vista biotecnológico. O objetivo do estudo foi avaliar a neuroproteção dos extratos Hidroalcoólico (EHAM), Metanólico (EMAM) e Acetato de Etila (EAAM) contra o dando oxidativo causado pelo H2O2 em fatias corticais de pintainhos, como os mecanismos envolvidos no insulto deste e a possível participação das MAPK nos mecanismos de ação. Para este estudo, utilizou-se microfatias corticais obtidas de pintainho (Gallus gallus) com idade entre 5 – 15 dias. As fatias de 3 mm de diâmetro foram incubadas por 1h em tampão HEPES-salina oxigenado na presença de H2O2 e/ou frações do extrato nas concentrações de 1-1000 μg/mL de A. microcarpum. Após os tratamentos, a viabilidade celular foi avaliada pelo teste colorimétrico MTT. A fração metanólica do extrato foi escolhida para dar continuidade aos experimentos, onde foi realizado ensaio de peroxidação lipídica (TBARS), tióis totais (GSH, PSH) e análise de Western Blot. Os resultados mostraram que a co-incubação de H2O2 na presença de EMAM e EHAM protegeu totalmente contra a queda na viabilidade causada pelo H2O2 nas concentrações de 10μg/mL e 100 μg/mL de extrato respectivamente. O tratamento não causou alteração nas concentrações de tióis proteicos e não proteicos. O EMAM reverteu a peroxidação lipídica induzida por H2O2 a partir da concentração de 100 μg/mL. Neste estudo também foi avaliada a participação de MAPK, ERK1/2 e morte celular apoptótica. A fosforilação da ERK foi estimulada quando as fatias foram incubadas com H2O2, este efeito não foi alterado pelo extrato. Para sabermos o mecanismo que está atuando na fosforilação da ERK, se faz necessário outros ensaios. Mais estudos serão conduzidos para aprofundar os mecanismos de neurotoxicidade e proteção bem como identificação de constituinte presente nesta espécie.

Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is the most common acute optic neuropathy in patients over fifty years of age. Management centers around prevention of second eye involvement, without uniformly accepted therapeutic intervention for the involved eye. Several researchers have assessed the benefit of steroids with conflicting results. Animal models based on selective photothrombosis of the microcirculation within the optic nerve head have contributed both to a better understanding of pathophysiological mechanisms associated to NAION; also, it has enabled the testing of potential therapeutic approaches. This study was deisigned to evaluate the efficacy of a single intravitreal triamcinolone acetonide injection (IVTA) in preserving retinal ganglion cells (RGCs) in a rodent model of anterior ischemic optic neuropathy (rNAION). Rodent NAION (rNAION) was induced in female Wistar rats. Animals were randomized into three groups: 1) untreated, 2) treated with 56 μg IVTA, and 3) treated with placebo (intravitreal saline). Procedures were performed in the left eye, with the right eye serving as an internal control. After 30 days, animals were sacrificed and eyes were assessed histologically for RGC number. The average number of RGCs was significantly higher in the control group when compared to rNAION subgroups (p < 0.001). No significant difference was seen between rNAION eyes treated with IVTA, placebo, and untreated eyes (P > 0.05%). In this rodent model for NAION, no therapeutic benefit of intravitreal steroid injection was identified.

O AVE é uma das principais causas de morte e incapacidade funcional em todo mundo, sendo dividido em dois subtipos: isquêmico, causado pela diminuição do fluxo sanguíneo; e hemorrágico, caracterizado pelo extravasamento de sangue nos tecidos encefálicos. Considerando a alta taxa de mortalidade e a gravidade das sequelas pós AVE, torna-se de extrema importância a busca por alvos terapêuticos que visem diminuir as sequelas causadas pelos quadros isquêmico e hemorrágico. Sendo assim, este estudo investigou os efeitos neuroprotetores do exercício físico (8 semanas previamente à lesão) em um quadro de AVE isquêmico (através da oclusão bilateral das artérias carótidas comuns) e os efeitos neuroprotetores da apocinina (posteriormente à lesão – 2, 6 e 24h – na dose 0,5mg/kg) em um quadro de AVE hemorrágico (através da infusão de colagenase no corpo estriado) em ratos Wistar. Para avaliar a função motora dos animais, foram utilizados os testes de Campo Aberto (CA), Rotarod (RR) e Escala de Déficit Neurológico (NDS), e, para avaliar o balanço redox estriatal, avaliamos a presença de EROs, TBARS (espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico) e capacidade antioxidante total (FRAP). Nossos resultados mostraram que o exercício físico é uma estratégia parcialmente eficaz de proteção em um modelo de AVE isquêmico. No entanto, a apocinina não se mostrou uma estratégia de neuroproteção eficaz em um modelo de AVE hemorrágico. Estes resultados revelam a possibilidade da utilização do exercício físico como estratégia de neuroproteção. A apocinina, por sua vez, precisa ser melhor estudada em casos de AVE hemorrágico, considerando a investigação do seu mecanismo, doses e tempos de administração.

O yacon (Smallanthus sonchifolius) é uma raiz tuberosa originária dos Andes, que vem despertando interesse devido suas propriedades medicinais. Popularmente a raiz é consumida in natura e as folhas na forma de chá para o tratamento do diabetes e distúrbio do colesterol. No entanto, pouco se sabe sobre outras propriedades dessa planta. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade in vitro dos extratos hidroalcoólicos das folhas e raízes do yacon, e também o efeito in vivo desses extratos sobre a neurotoxicidade induzida pela proteína β-amilóide (Aβ). Foi determinado o perfil fitoquímico da folha e raiz por cromatografia líquida de alto desempenho e para os testes in vitro foi realizado teste de viabilidade celular, atividade genotóxica e mutagênica em cultura de leucócitos nas concentrações de 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL e 100 μg/mL; citotoxicidade e morte celular por apoptose na linhagem celular 3T3 (1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL e 500 μg/mL). Investigamos também os efeitos da suplementação da folha e raiz do yacon na memória, no estado oxidativo do hipocampo e perfil bioquímico em um modelo de doença de Alzheimer (DA). Os animais dos grupos suplementados receberam o extrato por gavagem durante 14 dias consecutivos, no 15º dia os animais foram submetidos à cirurgia estereotáxica para injeção intrahipocampal de β-amilóide (Aβ). A suplementação foi mantida por mais 10 dias, até iniciarem os testes comportamentais. Foi realizado o teste de memória de reconhecimento de objetos (RO) e testes comportamentais. Parâmetros de estresse oxidativo foram avaliados no hipocampo através de metodologias clássicas. Os parâmetros bioquímicos foram analisados no soro por equipamento automatizado. Os principais compostos encontrados nas raízes e nas folhas foram os flavonóides quercetina e apigenina, respectivamente. Não foi observada atividade mutagênica nem citotóxica na cultura de leucócitos, já o potencial genotóxico foi observado nas doses mais elevadas de extrato de folhas (50 e 100 μg/mL) e raízes (100 μg/mL). As maiores concentrações do extrato da folha do yacon (50, 100 e 500 μg/mL) apresentaram atividade citotóxica e todas as concentrações induziram a apoptose nas células 3T3. Marcadores bioquímicos não mostraram diferença entre os grupos, com exceção dos níveis de glicose que estavam significativamente menores nos animais não-suplementados e submetidos a injeção intrahipocampal de Aβ. A folha e a raiz reduziram o estresse oxidativo no hipocampo, mas somente a suplementação com o extrato da folha do yacon evitou o déficit de memória induzido pela Aβ, no teste de memória de curta e longa duração. Estes resultados sugerem que o yacon é rico em compostos fenólicos e, em altas doses, pode apresentar um potencial tóxico. Hipotetizamos que os efeitos in vivo se devem pela maior concentração do composto fitoquímico apigenina nas folhas do yacon, já que estudos recentes indicam que esse composto possui um importante efeito neuroprotetor. Portanto, esse estudo demonstra as folhas do yacon como um candidato para futuro uso na prevenção e/ou tratamento da DA.

As doenças neurodegenerativas são patologias com grandes impactos sociais e econômicos. Os distúrbios cerebrais são condições patológicas os quais a cirurgia corretiva não pode ser amplamente utilizada, devido a isso os tratamentos são baseados em medicamentos que apenas aliviam os sintomas. Vários estudos observacionais e epidemiológicos sugerem que uma dieta rica em flavonoides melhora a função cognitiva e previne distúrbios neurodegenerativos em humanos. A crisina faz parte da classe flavona dos flavonoides e pode ser encontrada naturalmente no mel, própolis e várias espécies de plantas como a Passiflora coerulea. Em geral, a crisina exibe várias atividades biológicas e efeitos farmacológicos, incluindo atividades antioxidantes, anti-inflamatórias, anticancerígenas, antivirais e neuroprotetora. Neste contexto a doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo que afeta pessoas idosas em todo o mundo. A DP é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela progressiva degeneração do sistema nigrostriatal e perda substancial de neurônios da substancia negra parte compacta (SNc), além da depleção de dopamina (DA). A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica, desmielinizante, que resulta em distúrbios neurodegenerativos no sistema nervoso central (SNC). A EM é considerada uma das mais intrigantes doenças neurológicas em virtude de seu caráter autoimune, crônico, e frequentemente acomete adultos jovens. Neste trabalho o modelo de DP utilizado foi o da neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) o qual tem sido usado desde o final da década de 70. A neurotoxina hidroxilada análoga da DA, quando administrada diretamente no corpo estriado de animais destrói seletivamente os neurônios nigrostriatais dopaminérgicos. Neste estudo nós demonstramos um efeito protetor da crisina na dose de 10 mg/kg (intra gástrica – i.g) contra alterações comportamentais e cognitivas, aumento dos marcadores enzimáticos e não enzimáticos de estresse oxidativo e da neuroinflamação. Além disso, a crisina protegeu contra redução nos níveis de DA e seus metabólitos. Experimentalmente o modelo animal mais usado para o estudo da EM é o modelo denominado encefalomielite autoimune experimental (EAE) um modelo animal de doença do SNC, o qual é induzido por imunização com antígenos derivados de mielina, usada em laboratório para a investigação da EM por se assemelhar a essa condição em diversos aspectos. Neste modelo a crisina na dose de 20 mg/kg (i.g) conseguiu reduzir a perda de peso causado pelo modelo EAE bem como diminuir os sinais clínicos do modelo. A crisina inibiu a atividade da histona deacetilase (HDCA) bem como da glicogênio sintase kinase-3β (GSK-3β), reduziu os níveis das citocinas pró inflamatórias, além de regular as histonas acetiltransferases 3 e 4 (HAT3, vi HAT4). O presente trabalho demonstrou o efeito protetor da crisina frente a dois modelos de doenças neurodegenerativas, expondo a crisina como um importante alvo para mais estudos. Espera-se que futuramente a crisina venha a ser um auxiliar no tratamento à EM e a DP.

OBJECTIVES: Erythropoietin may have neuroprotective potential after ischemia of the central nervous system. Here, we conducted a study to characterize the protective effects of erythropoietin on retinal ganglion cells and gliotic reactions in an experimentally induced oligemia model. METHODS: Rats were subjected to global oligemia by bilateral common carotid artery occlusion and then received either vehicle or erythropoietin via intravitreal injection after 48 h; they were euthanized one week after the injection. The densities of retinal ganglion cells and contents of glial fibrillary acidic protein (astrocytes/Müller cells) and cluster of differentiation 68 clone ED1 (microglia/macrophages), assessed by fluorescence intensity, were evaluated in frozen retinal sections by immunofluorescence and epifluorescence microscopy. RESULTS: Retinal ganglion cells were nearly undetectable one week after oligemia compared with the sham controls; however, these cells were partially preserved in erythropoietin-treated retinas. The contents of glial fibrillary acidic protein and cluster of differentiation 68 clone ED1, markers for reactive gliosis, were significantly higher in retinas after bilateral common carotid artery occlusion than those in both sham and erythropoietin-treated retinas. CONCLUSIONS: The number of partially preserved retinal ganglion cells in the erythropoietin-treated group suggests that erythropoietin exerts a neuroprotective effect on oligemic/ischemic retinas. This effect could be related to the down-modulation of glial reactivity, usually observed in hypoxic conditions, clinically observed during glaucoma or retinal artery occlusion conditions. Therefore, glial reactivity may enhance neurodegeneration in hypoxic conditions, like normal-tension glaucoma and retinal ischemia, and erythropoietin is thus a candidate to be clinically applied after the detection of decreased retinal blood flow.

The effects of new derivatives of caffeine-8-thioglycolic acid (100 μM) on isolated rat brain synaptosomes, human neuroblastoma cell line SH-SY5Y and human recombinant MAOB enzyme (hMAOB) (1 μM) were evaluated. Most of the compounds, administered alone, didn’t show statistically significant neurotoxic effects on SH-SY5Y, when compared to the control (non-treated cells). Of all studied structures JTA-2Ox, JTA-11, JTA-12 and JTA-13 decreased cell viability. In combination with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) (100 μM), only JTA-1 and JTA-2 revealed neuroprotective effects, stronger than those of caffeine. All compounds administered alone revealed, neurotoxic effects on synaptosomes, as compared to nontreated synaptosomes. JTA-1, JTA-2 and JTA-3 showed lowest neurotoxic effects and were investigated in a model of 6-OHDA-induced oxidative stress. In this model of neurotoxicity, only JTA-1 and JTA-2 showed statistically significant neuroprotective effect, by preserving the synaptosomal viability and the level of reduced glutathione. Inhibition of hMAOB, was revealed by JTA-1 and JTA-2. They inhibited the enzyme by 23% and 25% respectively, thus approaching the selegiline activity, which was 42%. The possible mechanisms of neuroprotection of JTA-1 and JTA-2 might be a result from the inhibition of hMAOB, which catalyze the production of neurotoxic p-quinone from 6-OHDA.