O presente relatório encontra-se estruturado em duas secções: uma, relativa à componente de investigação e outra, referente ao estágio efetuado em farmácia comunitária. O primeiro capítulo (Capítulo I) aborda a componente de investigação, realizada sob a orientação da Professora Doutora Ana Clara Braz Cristóvão e da Mestre Ana Rita Curto. A revisão efetuada teve como objetivo estudar a Doença de Parkinson e a influência da nicotina na patologia. A Doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas, sendo a segunda patologia neurológica mais prevalente a nível mundial. Caracteriza-se como uma doença multissistémica, na qual sintomas motores e não motores se tornam evidentes com o evoluir da mesma. Entre os fatores de risco destaca-se a idade avançada, enquanto alguns compostos têm sido identificados como potencialmente neuroprotetores, com especial destaque para a nicotina. Apesar da controvérsia existente no meio clínico, estudos pré-clínicos sugerem que, por meio da ativação de diferentes subtipos de recetores nicotínicos da acetilcolina, a nicotina tem a capacidade de modular a neurotransmissão dopaminérgica, exercer efeitos anti-inflamatórios, reduzir o stress oxidativo, regular as vias apoptóticas e promover plasticidade sináptica. A análise da literatura disponível demonstrou resultados promissores em modelos animais, mas inconsistentes em ensaios clínicos, devido às incompatibilidades dos modelos parkinsonianos, às limitações metodológicas, à variabilidade interindividual e à falta de informação científica. Apesar das dúvidas, os recetores nicotínicos da acetilcolina, em particular os subtipos a7 e b2, mantêm-se como alvos farmacológicos de interesse para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas avançadas na Doença de Parkinson. O segundo capítulo (Capítulo II) refere-se à experiência profissionalizante na vertente de farmácia comunitária. O estágio foi realizado na Farmácia de Briteiros, concelho de Guimarães, no período de 3 de fevereiro a 20 de julho de 2025. Ao longo deste último capítulo serão descritas todas as atividades realizadas, os conhecimentos e competências adquiridas, bem como os desafios encontrados.

Este trabalho representa o meu relatório final para a conclusão do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas na Universidade da Beira Interior e está dividido em dois capítulos. O primeiro aborda a investigação laboratorial realizada no Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior, cujo objetivo foi desenvolver e caracterizar formulações lipossomais contendo um fármaco convencional, de baixo peso molecular e lipofílico, de ação neuroprotetora, com e sem DNA plasmídico, para aplicação terapêutica no contexto do Acidente Vascular Cerebral isquémico, privilegiando a via intranasal como estratégia de administração direcionada ao sistema nervoso central. Os lipossomas foram preparados com diferentes fases aquosas e proporções lipídicas, sendo caracterizados quanto ao tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta, encapsulação de DNA e estabilidade. Os resultados demonstraram que a preparação em tampão fosfato 10 mM pH 7,2 foi a condição mais promissora para formulações contendo DNA, enquanto a solução de NaCl 0,9% favoreceu a homogeneidade em formulações sem DNA. A presença do lípido catiónico (DOTAP) revelou-se essencial para a encapsulação de material genético, embora em elevadas proporções tenha comprometido a obtenção de lipossomas sem DNA homogéneos. O fármaco de baixo peso molecular até uma percentagem mássica de 15,4% não alterou significativamente as propriedades físico-químicas dos lipossomas com DNA, mas uma proporção mais elevada (20% m/m) levou à sua precipitação em lipossomas sem DNA passado alguns dias, não tendo o mesmo sido verificado na percentagem de 11,1% (m/m). Estes resultados confirmam o potencial dos lipossomas como sistema de encapsulação de um fármaco de interesse em neuroproteção, associado ou não a DNA plasmídico, tendo em vista a entrega de fármacos neuroprotetores em casos de AVC isquémico. No entanto, ainda são necessários mais estudos, de modo a melhorar a estabilidade e estudar a sua eficácia terapêutica. O segundo capítulo diz respeito à minha experiência profissionalizante na vertente de farmácia comunitária, cujo objetivo foi a aproximação à realidade da prática farmacêutica, através do contacto direto com os utentes e da resolução de casos clínicos reais. O estágio decorreu de fevereiro a junho de 2025, na Farmácia Gama Vieira em Tondela, sob a orientação da Dra. Fátima Vale. Durante este período, participei em diversas atividades da farmácia, nomeadamente a receção e conferência de encomendas, a dispensa de medicamentos, o aconselhamento farmacêutico e a preparação de medicamentos manipulados. Neste capítulo relatei a minha experiência, abordando temas como o funcionamento da farmácia, as atividades desempenhadas ao longo do estágio, bem como as diferentes experiências ao nível do aconselhamento farmacêutico. Este período proporcionou-me a oportunidade de integrar e aplicar os conhecimentos teóricos obtidos ao longo do curso à prática profissional, assim como aprimorar competências técnicas e humanas.

A doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa com sintomas motores e não motores. É uma doença multifatorial onde a disfunção de diferentes mecanismos celulares e moleculares contribuem para o desenvolvimento da patologia. Apesar de se conhecer a doença há mais de 200 anos, ainda não é totalmente conhecida a sua etiologia e não existe uma terapia que consiga parar a progressão da patologia. Fortes evidências implicaram o envolvimento do stress oxidativo produzido pela NOX1 na morte neuronal que ocorre na doença, resultando na hipótese de que a sua inibição pode ser bastante vantajosa para uma ação terapêutica. Neste sentido, tem sido feito um esforço na investigação de moléculas com capacidade inibitória da NOX1. Estudos anteriores do nosso grupo de investigação, demonstraram que um inibidor da NOX1 tem uma elevada capacidade neuroprotetora no contexto da DP. No entanto, tal como descrito para outros inibidores, este revelou ter um grave problema de solubilidade em soluções aquosas, sendo necessário utilizar um solvente, que por sua vez induz neurotoxicidade, limitando a sua utilização terapêutica. Assim, de forma a contornar este problema, recorreu-se a uma reformulação com base em líquidos iónicos para aumentar a solubilidade do inibidor, tornando-o suscetível de ser desenvolvido como terapêutica para a DP. Este trabalho teve por objetivo estudar a eficácia de uma das reformulações do inibidor, cujo rácio inibidor/liquido iónico é de 2:1 (N1inh-IL/2:1), no contexto experimental da DP, utilizando o modelo animal induzido pela toxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Assim avaliou-se o efeito da reformulação na função motora, na sobrevivência dopaminérgica da Substantia Nigra pars compacta (SNpc), na neuroinflamação em animais expostos à toxina e ao inibidor quando comparados com os animais unicamente expostos à toxina. Os resultados indicam que não se verificou um efeito protetor da reformulação ao nível da sobrevivência dopaminérgica nem da neuroinflamação. O modelo em estudo não mostrou diferenças em avaliações de coordenação motora e equilíbrio. Desta forma, os dados obtidos, sugerem que a reformulação em estudo, não tem capacidade de prevenir a neurodegeneração induzida pela toxina. Sendo a reformulação estudada a que contém maior concentração de inibidor, por comparação a outras em estudo, este trabalho permitiu identificar qual o rácio para o qual a formulação perde a sua eficácia.

Parkinson’s disease (PD) is the second common neurodegenerative disorder, characterized by massive dopaminergic (DAergic) neuronal death in the substantia nigra and resulting in a reduced level of dopamine (DA) in the striatum. Although both genetic and environmental factors are thought to affect the onset of PD, the precise mechanisms at the molecular level have not been fully elucidated. However, mitochondrial dysfunction and oxidative stress are suggested as major causes of neurodegeneration in PD. Astrocytes are the most abundant glial cell type in the brain. These cells are known to harbor powerful neuroprotective machinery allowing them to secrete neurotrophic factors and activate anti-oxidative stress pathways, thereby supporting neurons and ensuring their survival. Therefore, astrocyte dysfunction may compromise neuronal survival and, in this way, facilitate neurodegeneration. This dysfunction was already demonstrated in human samples and in experimental models of PD. Mutations in DJ-1 gene (PARK7) leading to a loss of functional protein cause familial PD and enhances the sensitivity to oxidative insults, so by elucidating DJ-1 physiological function important insights into PD will be achieved. DJ-1 is a ubiquitous redox-responsive cytoprotective protein with diverse functions but, of all the functions that have been attributed, perhaps the most important to PD is its neuroprotective role, most likely by its involvement in protection against oxidative stress. In recent studies, an increase in DJ-1’s expression was found in reactive astrocytes of PD brains and extensive research demonstrated that DJ-1 has the ability to protect neurons against oxidative and toxic insults. However, the function of astrocytic DJ-1 is still unknown. Taking these facts together, the aim of this study was to determine how neuron-astrocyte interaction influences the expression of DJ-1 when oxidative stress is present and how this expression contributes to neuroprotection. The present study allowed us to conclude that DJ-1 is expressed in primary midbrain cell cultures, and this expression is not altered when an oxidative stress insult is present. We also showed that the survival of DAergic neurons was affected when they were exposed to oxidative stress, even when astrocyes were present. Moreover, that lack of DJ-1 in culture media combined with oxidative insult impairs the astrocyte-mediated neuroprotection leading to a drastic reduction of neuronal survival. Furthermore, incubation of neurons with a fluorofore-coupled DJ-1 applied exogenously allowed us to demonstrate that in fact neurons have the ability to endocytose extracellular DJ-1. These results suggest that DJ-1 may be released into the culture medium probably by astrocytes when challenged with an oxidative stress insult and consequently be taken up by neurons, exerting a direct or indirect neuroprotective role.

Os tratamentos disponíveis para a doença de Parkinson, melhoram a qualidade de vida dos pacientes que sofrem desta doença neurodegenerativa. Contudo, nenhum mostrou ser unicamente eficaz em prevenir ou atrasar a progressão da doença. Nos últimos anos, muitos têm sido os avanços feitos na descoberta dos diversos mecanismos que estão implicados no desenvolvimento da doença de Parkinson como o stress oxidativo, disfunção mitocondrial, agregação proteica, inflamação, toxicidade celular e apoptose. Estes diversos mecanismos sugerem a descoberta de novos e potenciais tratamentos. A presente dissertação pretende realizar uma revisão sobre a neuroprotecção na doença de Parkinson, baseada na literatura científica mais recente, analisando os diferentes mecanismos implicados na doença e estratégias neuroprotetoras que estão em estudo clínico ou pré-clínico, e que aparentam ser as mais promissoras. Para a elaboração deste trabalho efetuou-se a pesquisa de artigos científicos na base de dados Pubmed, no sítio clinicaltrials.org e em alguns livros na área neurológica. A análise, inferida ao longo desta dissertação, permitiu mostrar que ainda existe um longo caminho a percorrer no que à neuroprotecção diz respeito. É necessário ultrapassar as barreiras atuais sobre a falta de conhecimento sobre a patofisiologia da doença e deficiências na metodologia usada para estudar a progressão da doença. Não obstante disso, a atividade destinada a compreender e tratar a doença de Parkinson tem crescido exponencialmente e em última instância, deverá resultar em terapias que modifiquem com sucesso o curso da doença. Num futuro próximo, esperam-se os resultados dos ensaios clínicos que ainda estão a decorrer.

Repetitive transcranial magnetic stimulation is a non-invasive and painless therapeutic technique, currently used as an auxiliary tool in the treatment of several neuronal disorders such as ischemic stroke. Ischemic stroke is a brain injury caused by partial or total interruption of blood flow to perfuse the cerebral tissue, with a high prevalence in the world and associated with high morbidity and mortality. HF-rTMS is able to promote motor recovery, improve ipsilesional cerebral hemodynamics and decrease global damage caused by stroke. These benefits result from changes triggered by rTMS in mechanisms such as synaptic plasticity, regulation of gene expression, neurogenesis and neuroprotection. Surprisingly, the effect of rTMS in glial cells has been underexplore. Using rat embryonic cortical cultures submitted to oxygen and glucose deprivation model, we evaluated the effects triggered by HF-rMS on astrocytes subjected to an ischemic insult and how these effects contribute to the promotion of neuroprotection. The results reveal that ischemic injury induces a 38% increase in the number of neurons expressing ERK1/2, but when neurons were exposed to medium conditioned by astrocytes or neuron-glial cultures stimulated with HF-rMS (10Hz) there was a 75% increase in these effects. Regarding the prevention of neurites degeneration, the results demonstrated that there was a decrease in the degeneration and maintenance of neuronal arborization, in neurons subjected to both conditioned media. HF-rMS applied after the ischemic injury was also able to induce an increase of approximately 60% in the expression of BDNF but was not able to alter astrocytic phenotype. The results obtained show that HF-rMS promotes the increase of BDNF expression by astrocytes, the release of factors that prevent the degeneration of neurites, the maintenance of neuronal arborization and the increase of ERK1/2+ neurons. Taken together these results show that HF-rMS is a promising tool for the treatment of neurological disorders.

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disease associated with the loss of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) and the abnormal accumulation of a-synuclein (a-syn) aggregates in the form of Lewy bodies and Lewy neurites. As there is no cure for this disease and existing treatments often have secondary symptoms, the development of new strategies to fight this neurodegenerative disease is urgent. Recent evidence suggests that microRNAs (miRNAs) may be a possible therapeutic solution for this disease. Their main function is to act as silencers in posttranslation, pairing with complementary messenger RNA (mRNA) and regulating their stability and translation. The main objective of this thesis was to investigate whether microRNA-106a (miRNA-106a) acts as a novel therapeutic agent in PD by protecting dopaminergic neurons and counteracting motor functional deficits. In this study, an animal model was used in which PD was induced by the stereotaxic injection with neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the striatum (ST), followed by the injection with miRNA-106a into the substantia nigra (SN). Seven days after the surgeries, behavioral tests were performed to assess motor coordination and immunohistochemistry was performed for tyrosine hydroxylase (TH), a marker of dopaminergic neurons, to assess neuroprotection. Results obtained from behavioral tests on the rotarod and the apomorphine test showed that mice treated with 6-OHDA and miRNA-106a had improved motor behavior compared to mice treated with 6-OHDA only. This motor improvement was accompanied by increased survival of dopaminergic neurons, evidenced by an increase in the number of TH-positive neurons in the SN, as well as an increase in the intensity and area of the stained region for TH in the ST. In summary, these results suggest that miRNA-106a may have a neuroprotective effect on dopaminergic neurons and is able to improve motor behavior in an animal model of PD.

O envelhecimento é o principal fator de risco para a doença de Parkinson, a segunda doença neurodegenerativa mais comum, caracterizada principalmente pela perda progressiva e seletiva dos neurónios dopaminérgicos da via nigroestriatal, resultando numa diminuição dos níveis de dopamina nesta região e consequentemente em sintomas motores. Vários são os mecanismos que desempenham um papel importante na perda neuronal, estando entre eles o stress oxidativo, que leva à formação de radicais livres, e os processos neuroinflamatórios. Um dos principais objetivos da investigação no âmbito da DP é o desenvolvimento de fármacos que retardem ou parem o processo neurodegenerativo. A Klotho é uma proteína supressora do envelhecimento e a sua sobre-expressão em ratos está associada a uma extensão do tempo de vida. Estudos anteriores mostraram que os níveis circulantes de Klotho diminuem com a idade e que existe uma forte correlação entre os níveis elevados da sua expressão e o estado saudável dos animais. Apesar das múltiplas funções atribuídas a esta proteína, o seu mecanismo de ação no cérebro não está completamente compreendido. Contudo, tem sido relatado que esta proteína melhora a plasticidade sináptica, as funções cognitivas e, para além disso, pode influenciar uma variedade de estruturas e funções do sistema nervoso central durante a maturação e o envelhecimento. Esta proteína é altamente expressa no cérebro, principalmente no plexo coróide e nos neurónios. Estudos recentes têm atribuído à Klotho um papel importante na neuroprotecção. Menores concentrações de Klotho foram detetadas no líquido cefalorraquidiano de doentes de Alzheimer, quando comparado com indivíduos saudáveis da mesma idade. Esta proteína aumenta a resistência ao stress oxidativo por ativação de algumas vias de sinalização e, quando adicionada exogenamente in vitro, protege os neurónios do hipocampo da excitotoxicidade induzida pelo glutamato, através do sistema Trx/Prx, tendo sido proposta como um novo alvo terapêutico para a doença de Alzheimer. No que diz respeito à doença de Parkinson, sabe-se apenas que em murganhos mutantes para o gene da Klotho existe uma diminuição no número de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra e nos níveis de dopamina no estriado, e que animais transgénicos para a Klotho (que sobre-expressam esta proteína) são menos vulneráveis ao stress oxidativo induzido pela exposição a MPTP. Posto isto, o primeiro objetivo deste trabalho, foi averiguar uma possível ação neuroprotetora da Klotho num modelo celular da doença de Parkinson. Para tal foram utilizadas culturas primárias enriquecidas em neurónios e co-culturas de neurónios-glia do mesencéfalo ventral, às quais foi adicionada Klotho recombinante. A toxicidade dopaminérgica foi induzida por exposição ao 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+) e a extensão da lesão foi analisada por imunocitoquímica. Os resultados obtidos mostraram que a Klotho, quando aplicada exogenamente e previamente à lesão, previne a perda dos neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral induzida pela toxina dopaminérgica MPP+ e que a presença de astrócitos é importante para esta neuroprotecção. O mecanismo pelo qual exerce este efeito é ainda desconhecido e merece uma investigação mais aprofundada. A ação neuroprotetora da Klotho é abolida quando esta é administrada após ou no momento da indução da lesão dopaminérgica. O segundo objetivo deste trabalho, foi avaliar o papel da Klotho no controlo da inflamação mediada pela microglia. Utilizando culturas primárias enriquecidas em microglia do mesencéfalo ventral e o lipopolissacarídeo (LPS) como agente estimulante, verificámos que a Klotho consegue diminuir a libertação de NO pela microglia, induzida pelo LPS, sendo uma possível via pela qual a Klotho modula a reatividade microglial e consequentemente poderá exercer um efeito neuroprotetor. Conjuntamente, os resultados obtidos neste trabalho mostram pela primeira vez que a administração exógena da Klotho é neuroprotetora para os neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral e exerce um efeito anti-inflamatório na microglia, podendo ser um ponto de partida na compreensão do papel da Klotho no contexto da doença de Parkinson. Os efeitos da administração exógena desta proteína deverão ser investigados em modelos animais da doença de Parkinson a fim de avaliar o seu potencial terapêutico nesta doença.

O Acidente Vascular Cerebral (AVC) caracteriza-se por um défice focal ou global da função cerebral, de início súbito, que persiste por um período superior a 24 horas, sem outra causa aparente senão a de origem vascular. Atualmente, o AVC é a segunda maior causa de morte no mundo e a principal causa de morte e incapacidade em Portugal, com um gasto de milhões de euros todos os anos. O tratamento atual é limitado, consistindo no restabelecimento da perfusão sanguínea do tecido cerebral isquémico através da trombólise intravenosa e trombectomia endovascular. No entanto, apesar dos seus comprovados benefícios, estas duas terapias apresentam diversas limitações e critérios de inclusão e exclusão, levando a que muitos dos pacientes não sejam intervencionados com estas técnicas. A presente dissertação tem como objetivo realizar uma revisão de novas terapias de intervenção no AVC, as terapias neuroprotetoras, quer de estudos em modelos animais e ensaios clínicos passados, como os que estão em andamento ou programados. A neuroprotecção corresponde a um tratamento com a capacidade de prolongar a tolerância do tecido cerebral à isquemia. As terapias neuroprotetores tem sido estudadas à décadas, no entanto, apesar do seu aparente sucesso em modelos animais, esses mesmos resultados não tem sido demonstrados em ensaios clínicos em humanos. É necessária uma otimização dos estudos em modelos animais, de modo a melhor mimetizarem as características dos doentes que sofrem AVC, e possivelmente realizar novos estudos que combinem terapias neuroprotetoras.

Lipopolysaccharide (LPS) is an inflammatory agent widely used to induce peripheral inflammatory responses in animal models. When administered at low concentrations and over a short time interval, it has the ability to induce neuroprotection in animal models of Alzheimer’s Disease and stroke. This neuroprotective effect is due to the activation of the peripheral immune system and subsequently activation and induction of innate immune memory in microglial cells. Thus, the main objective of this work was to understand the effects of LPS and histamine, a biogenic amine also involved in peripheral inflammatory reactions, in the ability to induce innate immune memory and, consequently, to promote neuroprotection of dopaminergic neurons in an animal model of Parkinson’s Disease (PD). For this, C57BL/6J mice were subjected to intraperitoneal administration with LPS or histamine and, after 3 weeks, were exposed to intrastriatal injury with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) to mimetize PD. The inflammatory response was evaluated by the expression of proinflammatory cytokines (TNF-a and IL-1ß) and anti-inflammatory cytokines (IL-10) in the blood, and by the expression of the ionised calcium binding adapter molecule 1 (Iba-1), a cell marker of microglia and macrophage cells, in the brain. To evaluate dopaminergic survival and motor behavior, immunohistochemistry for tyrosine hydroxylase (TH) and apomorphine test were use, respectively. The results suggest that LPS and histamine induce activation of the peripheral inflammatory response with consequent activation of microglia, triggering innate immune memory. In the long term, it is verified that these inflammatory stimuli protect dopaminergic neurons in a PD model, as well as motor recovery, resulting in a new mechanism of prevention and cellular and functional improvement of PD.