Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (≅18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de ≅35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial.

A matriz extracelular (MEC) é capaz de modular a adesão celular, induzindo processos de sinalização celular. No estado de aderência intermediária, induzido por proteínas matricelulares, as células tendem a se diferenciar, migrar e proliferar. A tenascina-C é uma proteína matricelular amplamente secretada em gliomas que está envolvida na proliferação e angiogênese tumoral. A MEC de gliomas, possui elevada incorporação de tenascina-C (TN-C), uma glicoproteína matricelular desadesiva que compete com a glicoproteína adesiva fibronectina (FN), desestabilizando os contatos focais e induzindo proliferação celular em gliomas. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o papel da TN-C tumoral no fenótipo angiogênico de células endoteliais. Recentemente em um trabalho publicado pelo nosso grupo observamos que as células endoteliais semeadas sobre matrizes de glioma (U373 MG) aderem menos e são deficientes na capacidade de formar tubos quando comparadas com àquelas plaqueadas sobre MEC de HUVECs. No entanto, neste trabalho, reproduzimos este fenótipo semeando as células endoteliais em suportes de TN-C /FN miméticos da composição da matriz tumoral nativa. Por western blotting, observamos um aumento na fosforilação em treonina 638 da proteína PKCα, um possível sítio inibitório, e um aumento na ativação de PKCδ. O efeito antagônico na regulação dessas isoformas de PKC foi demonstrado quando usamos inibidores seletivos de PKC α e δ e um ativador de PKCα (PMA). Observamos que quando tratamos as HUVECs plaqueadas sobre MEC de U373 com PMA, resgatamos a capacidade dessas células de formar tubos, o pré-tratamento dessas HUVECs com inibidor de PKC δ (rotlerina) resgatou parcialmente a capacidade tubulogênica dessas células. O pré-tratamento das HUVECs que foram semeadas sobre MEC da HUVEC (que formam tubos normalmente) com um inibidor de PKC α (RO320432) levou a diminuição da capacidade tubulogênica. Além disso, esta matriz também induz ativação de ERK e AKT. Investigamos também se o bloqueio dos diferentes domínios da TN-C na matriz derivada de glioma poderia, de alguma forma, reverter o defeito angiogênico das células, propiciado pela interação com a matriz extracelular de gliomas. O pré-tratamento da matriz extracelular de glioma com anticorpos anti-TN-C (contra os domínios FNIII 1-3, 4-5 FNIII e N-terminal) resgatou parcialmente a capacidade das células endoteliais de formar tubos. Nossos dados sugerem que a indução do fenótipo vascular observado em muitos gliomas, com predomínio de vasos mal formados e sub-funcionais, pode ser parcialmente devido ao comprometido da sinalização mediada por PKCs em células endoteliais, bem como do aumento da ativação das vias de ERK e Akt.

A progressão tumoral cria um microambiente que influencia a plasticidade, migração e invasão de células vizinhas, levando à formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré- existentes, um processo conhecido como angiogênese. Esse processo depende da produção de fatores de crescimento, pelas células tumorais, que estimulam o crescimento de novos vasos sanguíneos. Porém, a adesão à matriz extracelular (MEC) também é importante para regular a sobrevivência, proliferação e motilidade da célula endotelial, durante a angiogênese. Integrinas são as principais moléculas de adesão responsáveis pelas interações célula-matriz, e pela transdução de sinais que regulam a forma, sobrevivência e proliferação celular. Integrinas podem também ativar receptores tirosina quinase independentemente da sua atividade quinásica intrínseca, como o VEGFR2, através de um processo conhecido como transativação. Assim, é possivel propagar as sinalizações intracelulares para garantir o crescimento, sobrevivência e diferenciação celular durante a angiogênese normal ou patológica. Neste estudo, investigamos os efeitos das desintegrinas, que são ligantes seletivos de integrinas, alterando suas funções. Por esse motivo, as desintegrinas se tornaram importantes para o desenvolvimento de terapias anti câncer. Nesse trabalho, avaliamos as vias de sinalização intracelulares envolvidas nas interações entre a matriz extracelular tumoral e as células endoteliais, e como essas interações podem levar à angiogênese. Mostramos que a matriz tumoral, obtida da linhagem celular de melanoma humano (MV3), apresentava diferenças estruturais, comparada à matriz não tumoral, obtida a partir da linhagem celular de melanócito humano (NGM). Observamos que, diferentemente da MEC da NGM, a MEC da MV3 aumentou a polimerização de F-actina nas HMEC1, corroborando com o aumento da fosforilação de AKT e FAK. Mostramos um aumento na fosforilação de VEGFR2, além de um aumento da associação de FAK com c-Src, nas HMEC1 cultivadas 24 horas sobre a MEC da MV3. Finalmente, vimos que desintegrinas reduziram a polimerização e distribuição de F-actina nas HMEC1 cultivadas sobre a MEC da MV3, e inibiram a migração de células endoteliais plaqueadas sobre a MEC tumoral, sugerindo um importante papel na prevenção da metástase e do desenvolvimento tumoral. Esses resultados sugerem que a matriz tumoral modifica o comportamento da célula endotelial, ativando vias de sinalização dependentes de integrinas que estão relacionadas a eventos importantes no processo angiogênico. Essas alterações provavelmente são potencializadas pela ativação do VEGFR2.

A angiogênese é um evento importante em diversos processos fisiológicos e patológicos, como o desenvolvimento tumoral. Sua inibição é considerada uma estratégia importante no desenvolvimento de terapias anti-câncer. Um importante aspecto da formação de novos vasos é a coordenação da migração e da invasão das células endoteliais em direção ao sítio angiogênico. Para isso, é essencial a degradação da matriz extracelular por proteases. Proteínas matricelulares, como a trombospondina-1 (TSP-1), têm sido associadas com a angiogênese por induzirem um estágio intermediário de adesão, permitindo uma maior migração celular. Nosso grupo observou que o fragmento recombinante de 18kDa do domínio N-terminal da TSP-1 (TSP18) e peptídeos GAG-dependentes derivados do TSP-18 (TSP Hep I e TSP Hep II) possuem atividade pró-angiogênica. Esta atividade está relacionada à ligação desses domínios ao receptor sindecan-4 e à ativação de proteína quinase C (PKC). O presente trabalho tem como objetivo investigar o papel de proteases na modulação da angiogênese induzida pelo TSP Hep II. A atividade de metaloproteases (MMP) associadas à membrana celular de HUVECs foi determinada por zimografia, a partir de extratos celulares obtidos após a adesão da células ao TSP Hep II. O peptídeo não foi capaz de induzir um aumento na atividade da MMP-2. Avaliamos ainda, por espectrofluorometria, a presença de catepsinas no meio condicionado de células endoteliais aderidas ao TSP Hep II. Observamos que o peptídeo foi capaz de induzir a secreção de catepsinas endoteliais. Verificamos ainda que o aumento da migração e da tubulogênese promovido pelo TSP Hep II é dependente da secreção de catepsinas, uma vez que a utilização de um inibidor específico (E-64) foi capaz de reverter o efeito deste peptídeo nestes eventos. Além disso, observamos o envolvimento de catepsinas na formação de vasos <i>in vivo</i> induzida pelo TSP Hep II. Utilizando-se de substratos fluorogênicos específicos, averiguamos que as catepsinas B, K e L não estão envolvidas neste processo. Este trabalho demonstra que o TSP Hep II induz a formação de estruturas tubulares em HUVEC, através de um mecanismo dependente da secreção de cisteíno-proteases.

Peripheral arterial disease (PAD) is mainly caused by an obstructive artherosclerosis, which results in a mismatch between oxygen supply and demand. Diabetes is an important risk factor for PAD and it is present in almost 50% of the patients with limb ischemia. Critical limb ischemia (CLI) is the end stage of PAD, being characterized by severe obstruction of blood flow to the affected extremity, which results in ischemic rest pain, ulcers or gangrene. Despite substantial evidence of their efficacy in preclinical studies, as well as some promising phase I/II clinical trials, larger randomized clinical trials on angiogenic therapies for CLI have been unsatisfactory. Here, we investigated the ability of low-dose ionizing radiation (LDIR) to stimulate therapeutic neovascularization, in murine models, in a context of hindlimb ischemia (HLI), conjugated or not with diabetes. We demonstrate that 0.3 Gy, administered for four consecutive days, significantly improves blood perfusion in the murine ischemic limb by stimulating angiogenesis and arteriogenesis, as assessed by laser Doppler flow, capillary density and collateral vessel formation. LDIR significantly increased the circulating levels of VEGF, PlGF and G-CSF, as well as the number of circulating endothelial progenitor cells (EPCs), mediating their incorporation into ischemic muscles. These effects were dependent upon LDIR exposition on the ischemic niche (thigh and shank regions). In irradiated ischemic muscles, these effects were independent of the recruitment of monocytes and macrophages. Also, the vasculature in an irradiated non-ischemic bed was not affected and after 52-week LDIR exposure no differences in the incidence of morbidity and mortality were seen. Additionally, in diabetic mice, our data suggest that 0.3 Gy applied during four consecutive days significantly promote blood perfusion, capillary and collateral vessel densities in response to HLI induction. These findings disclose an innovative and non-invasive strategy to induce therapeutic angiogenesis in a murine model of severe HLI, emerging as a novel approach in the treatment of CLI.

Introdução: A retinopatia diabética (RD) é a principal causa de cegueira em indivíduos em idade ativa. As principais técnicas utilizadas para avaliar a RD e a retinopatia diabética proliferativa (RDP) são a angiografia fluoresceínica (AF) e a tomografia de coerência ótica (OCT). A OCT é uma técnica não invasiva usada clinicamente para diagnosticar e monitorizar alterações estruturais na RD. Recentemente foi desenvolvida uma nova técnica de OCT, a tomografia de coerência ótica angiográfica (OCT-A), que permite a avaliação do fluxo dos complexos neovasculares (NVC) e a criação de um mapa vascular ao nível da microcirculação. Este estudo tem como objetivo a descrição das características da RDP utilizando OCT-A. Métodos: Estudo retrospetivo de 23 olhos de 21 doentes com RDP que foram submetidos a OCT-A para avaliação de NVCs. As imagens foram adquiridas durante a observação clínica de rotina com o OCT-A DRI Triton Swept-Source, Avanti RTVue XR e Cirrus HD-OCT 5000. A segmentação foi ajustada para incluir a vascularização entre a cavidade vítrea e a membrana limitante interna (MLI). A presença de NVC foi confirmada por observação clínica, retinografia e/ou por AF. Resultados: Foram identificados 35 NVCs, correspondentes em 34.3% dos casos a neovascularização do disco (NVD) e em 65.7% a neovascularização elsewhere (NVE). Os NVE foram identificados no OCT estrutural como tecido de média ou alta refletividade que penetrava a MLI e os NVD como tecido sobre ao disco ou fazendo protusão do disco com configuração em “sea fan”. A OCT-A mostrou fluxo em todos os NVE e em 66.7% dos NVD, de acordo com atividade neovascular. Áreas sem fluxo ou com escassos capilares, interpretadas como não perfusão capilar, foram identificadas adjacentes a 87.0% dos NVE. Anomalias microvasculares intrarretinianas (IRMAs) foram encontradas próximo de 69.6% dos NVE. Verificou-se ausência de fluxo em 4 NVD, todos eles com cone de sombra posterior associado e considerados inativos. Conclusões: A OCT-A é uma técnica de imagem recente que é útil na RDP para avaliar NVCs, IRMAs e áreas de não perfusão. Como tal, tem um papel promissor no diagnóstico, monitorização e orientação terapêutica da RDP.