Atualmente lidamos com um grande volume de dados e vários programas que permitem fazer análise destes dados. No entanto, os valores omissos representam um problema frequente no processo de análise destes conjuntos de dados que podem surgir por vários motivos. Por exemplo, podem ser resultados perdidos das análises duma amostra, ou alguns indivíduos não responderem a um determinado questionário. Visto que a maior parte dos programas e algoritmos utilizados para o tratamento de dados requere conjuntos de dados sem valores omissos, isto é, dados completos, a sua existência pode limitar a análise dos dados. Daí, surge a necessidade de recorrer a métodos de imputação de valores omissos. Nesta dissertação foram utilizados e comparados seis métodos distintos de imputação, disponíveis no software R e avaliado o seu desempenho em conjuntos de dados relacionados com a área da educação, nomeadamente dados da avaliação nacional do rendimento escolar (Prova Brasil). Foi estudada uma amostra de 20408 estudantes para testar os seis algoritmos em quatro subconjuntos de dados gerados por simulação com diferentes percentagens de valores omissos, considerando 5%, 10%, 15% e 20% nas variáveis de interesse. Foram explorados métodos de imputação simples (Média, Mediana e Moda), métodos baseados em aprendizagem automática (kNN e bPCA) e um método de imputação múltipla (MICE). Foi avaliado o desempenho de cada método adotado neste trabalho calculando os respetivos erros de imputação através as métricas RMSE e MAE. Os resultados obtidos mostram que o método de imputação pela Moda forneceu quase de forma constante menores valores de erro.

Caffeine is one of the most worldwide consumed methylxanthines. It is well-known for its thermogenic and cell metabolism modulating effects. Based on methylxanthines' chemical structure, 8-(3-phenylpropyl)-1,3,7-triethylxanthine (PTX) is a novel adenosine antagonist with higher receptor affinity than caffeine. Therefore, we hypothesized that PTX metabolic effects could be stronger than those of caffeine. For that purpose, murine 3T3-L1 cells were cultured in the presence of increasing doses of PTX or caffeine (0.1, 1, 10 and 100 μM) for 24 h. Cytotoxicity was evaluated by reduction of tetrazolium salt (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) release. Cell metabolites released to the culture medium were identified and quantified by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). Cellular oxidative profile was also evaluated. Our results showed that PTX displayed no signs of cytotoxicity at all studied concentrations. When compared with caffeine, PTX increased glucose, pyruvate, and glutamine consumption, as well as lactate, alanine, and acetate production. Additionally, PTX decreased protein oxidation, thus protecting against oxidative stress-induced damage. These results illustrate that PTX is a stronger and less cytotoxic caffeine substitute with potential applications as metabolic modulator and a good candidate for novel drug design.

Messenger RNA (mRNA) activated matrices (RAMs) are interesting to orchestrate tissue and organ regeneration due to the in-situ and sustained production of functional proteins. However, the immunogenicity of in vitro transcribed mRNA and the paucity of proper in vivo mRNA delivery vector need to be overcome to exert the therapeutic potential of RAM. We developed a dual mRNAs system for in vitro osteogenesis by co-delivering NS1 mRNA with BMP2 mRNA to inhibit RNA sensors and enhance BMP-2 expression. Next, we evaluated a lipopolyplex (LPR) formulation platform for in vivo mRNA delivery and adapted the LPRs for RAM preparation. The LPR formulated BMP2/NS1 mRNAs were incorporated into an optimized collagen-nanohydroxyapatite scaffold and freeze-dried to prepare ready-to-use RAMs. The loaded BMP2/NS1 mRNAs lipopolyplexes maintained their spherical morphology in the RAM, thanks to the core-shell structure of LPR. The mRNAs release from RAMs lasted for 16 days resulting in an enhanced prolonged transgene expression period compared to direct cell transfection. Once subcutaneously implanted in mice, the BMP2/NS1 mRNAs LPRs containing RAMs (RAM-BMP2/NS1) induced significant new bone tissue than those without NS1 mRNA, eight weeks post implantation. Overall, our results demonstrate that the BMP2/NS1 dual mRNAs system is suitable for osteogenic engagement, and the freeze-dried RAM-BMP2/NS1 could be promising off-the-shelf products for clinical orthopedic practice.

Mitochondrial gene therapy seems to be a valuable and promising strategy to treat mitochondrial disorders. The use of a therapeutic vector based on mitochondrial DNA, along with its affinity to the site of mitochondria, can be considered a powerful tool in the reestablishment of normal mitochondrial function. In line with this and for the first time, we successfully cloned the mitochondrial gene ND1 that was stably maintained in multicopy pCAG-GFP plasmid, which is used to transform E. coli. This mitochondrial-gene-based plasmid was encapsulated into nanoparticles. Furthermore, the functionalization of nanoparticles with polymers, such as cellulose or gelatin, enhances their overall properties and performance for gene therapy. The fluorescence arising from rhodamine nanoparticles in mitochondria and a fluorescence microscopy study show pCAG-GFP-ND1-based nanoparticles' cell internalization and mitochondria targeting. The quantification of GFP expression strongly supports this finding. This work highlights the viability of gene therapy based on mitochondrial DNA instigating further in vitro research and clinical translation.

A esquistossomose acomete 207 milhões de pessoas, com mais de 200 mil mortes anuais. Seu principal agente etiológico é o helminto Schistosoma e o principal modelo experimental, o camundongo. Linhagens de camundongos selecionadas geneticamente para susceptibilidade (TS) e resistência (TR) a tolerância imunológica constituem bons modelos para o estudo da resposta imunológica específica e inespecífica nas infecções. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a infecção experimental por S. mansoni nestes camundongos, evidenciando a imunopatologia por diversos parâmetros na fase aguda da infecção. TR e TS não diferiram quanto a penetração de cercárias, recuperação de vermes adultos, fecundidade/produtividade de ovos das fêmeas de S. mansoni, mas predominaram ovos mortos em TS. Quanto maior o número de casais, maior a probabilidade de troca de casais e regressão sexual da fêmea, além de pequena redução da produtividade de ovos. Análise ultraestrutural dos parasitos machos recuperados de TS apresentaram tubérculos edemaciados, espinhos encurtados e em menor densidade que os parasitos dos TR. O tegumento dos parasitos recuperados de TS apresentou-se desorganizado, intensamente vacuolizado e com tendência a se desprender da superfície e espinhos internalizados e células vitelínicas desorganizadas. TS desenvolveram granulomas hepáticos grandes, com fibras radiais e predomínio do estágio exsudativo-produtivo com características de fase produtiva (EP/P), enquanto camundongos TR desenvolveram granulomas menores, com fibras concêntricas e predomínio de granulomas exsudativo-produtivos. TS desenvolveu hepatomegalia mais acentuada na fase aguda da infecção e exacerbada esplenomegalia na fase crônica. A aspartato aminotransferase mais elevada nos TR foi coerente com a acentuada histólise nos granulomas iniciais dos TR. É possível que a histólise menor em TS tenha contribuído para sua intensa hepatomegalia na fase aguda. Leucócitos totais séricos aumentaram em TS, nas fases aguda e crônica, mas não em TR. TS apresentaram anemia durante a fase crônica da infecção, possivelmente devido ao desvio na hematopoiese medular para a produção de leucócitos ou apoptose das hemácias. A mieloperoxidase neutrofílica hepática e no íleo foi maior em TS e a peroxidase de eosinófilos foi mais elevada no íleo do TS. Ambas as linhagens produziram IFN-γ, mas os níveis funcionais de IFN-γ foram diferentes nas duas linhagens em cultura de células. É possível que a imunopatologia hepática grave na linhagem TS possa estar relacionada aos altos títulos IFN-γ. TS produziu IL-10 em maior quantidade, entretanto esta citocina não foi capaz de regular o crescimento exacerbado dos granulomas hepáticos. Altos títulos de IL-4 na linhagem TS também são coerentes com a exacerbação dos granulomas, pois, como a IL-13, a IL-4 induz síntese de colágeno e está relacionada ao desenvolvimento da fibrose no granuloma esquistossomótico. Observamos redução do percentual relativo de células T CD4+ hepáticas de animais infectados em ambas as linhagens e redução percentual nas subpopulações de linfócitos B na medula óssea (precursores, linfócitos B imaturos, maduros e plasmócitos) mais acentuada em TS que em TR, possivelmente devido a extensa mobilização de B imaturos induzida pela inflamação ou desvio da hematopoiese para síntese de granulócitos em TS. Quantitativamente, TR não alterou suas subpopulações de linfócitos B. TS e TR são bons modelos para estudo da resposta imunológica na infecção esquistossomótica experimental. Novos estudos são necessários para confirmar nossas propostas e compreender os mecanismos envolvidos na diferença da resposta imunológica dessas linhagens na relação schistosoma-hospedeiro.

A Tolerância Oral (OT) é um método de indução de supressão imunológica periférica e tem sido considerada como uma estratégia terapêutica para doenças inflamatórias auto-imunes. Recentes resultados (Tavares et al 2006) com linhagens de camundongos selecionadas para fenótipos extremos de susceptibilidade (camundongos TS) e resistência (camundongos TR) à tolerância oral, mostraram diferenças no desenvolvimento da lesão e carga parasitária após a infecção por Leishmania amazonensis. A supressão bystander pela tolerância oral foi inicialmente descrita como um mecanismo em que células T regulatórias desencadeadas por um antígeno-específico ingerido, são capazes de suprimir a resposta a um antígeno-não-específico, quando este é administrado concomitantemente ao antígeno-específico. As linhagens TR e TS foram utilizadas para o desenvolvimento de protocolos de supressão bystander, com o objetivo de inibir a resposta inflamatória induzida pela infecção por L. amazonensis. Os camundongos receberam 1, 2, 5 ou 25 mg de OVA intragástrica (IG) durante dois dias consecutivos, e uma semana depois foram infectados com 107 promastigotas de L. amazonensis e desafiados com 50 µg OVA solúvel no mesmo sítio. Em outro protocolo, camundongos foram tratados com OVA IG e desafiados uma semana após com este mesmo antígeno seguido de antígeno de leishmania em CFA no mesmo sítio bystander. Na semana seguinte foram infectados na pata oposta. Camundongos TR tolerizados com 25 mg de OVA desenvolveram lesão inflamatória exacerbada, quando comparados com o grupo controle, enquanto os animais tolerizados com 1, 2 ou 5 mg de OVA desenvolveram uma lesão menor. O efeito bystander não modificou a carga parasitária. Independentemente do protocolo utilizado, os camundongos TS desenvolveram uma lesão menor. As citocinas IFN-y e IL-10 foram aumentadas em animais infectados de ambas as linhagens em comparação com animais não infectados. Nos grupos TR submetidos a baixa dose de OVA IG bystander (1, 2 e 5 mg) observamos diminuição de IFN-y e o aumento de IL-10 sugerindo mudança para um perfil regulatório condizente com a diminuição da lesão inflamatória nestes grupos. Nos grupos TS tolerizados observamos redução de IFN-y e aumento de IL-10, embora permaneçam mais altos que nos TR, independente da dose oral a que foram submetidos. O efeito bystander, com doses baixas ou altas, não alterou a carga parasitária mostrando a dissociação desta com a modulação da patogenia. Os níveis de IFN-y não se mostraram associados a redução da carga parasitária em TR e TS, já que na linhagem TS observou-se alta carga parasitária apesar do alto nível de IFN-y enquanto que a linhagem TR apresentou menor nível de IFN-y e baixa carga parasitária. A linhagem TS apresentou intrinsecamente uma proporção maior de células Treg (CD25+Foxp3+) que a linhagem TR, mas animais de ambas as linhagens atingiram a mesma proporção de células Treg após infectados com L. amazonensis. Uma compreensão melhor dos mecanismos regulatórios da imunidade inata e adaptativa nas fases iniciais da infecção é necessária para o desenvolvimento de protocolos capazes de limitar a inflamação e promover a eliminação dos parasitas.

Estudos demonstram uma forte relação entre o fumo e o consumo de álcool, de forma que a co-ocorrência de alcoólicos e fumantes é muito freqüente. Esse estudo buscou avaliar os efeitos do tabaco, etanol e da dupla exposição tabaco+etanol na memória/aprendizado e no sistema colinérgico central de camundongos durante a exposição e durante o período de retirada das drogas. Do 30o ao 45o dia de vida pós-natal (PN30-PN45), camundongos Suiços foram expostos à fumaça de cigarros gerada a partir da queima de cigarros para pesquisa (0,7 mg de nicotina, 9,4 mg de alcatrão e 12 mg de CO) em uma máquina de fumaça de cigarro durante 8h/dia e/ou a injeções i.p. de etanol (2g/kg, 25%, v/v) em dias alternados. Assim, foram utilizados 4 grupos experimentais: FUM+ETAN (exposição à fumaça de cigarros e injeção i.p. de etanol); FUM (exposição à fumaça de cigarros e à salina i.p), ETAN (etanol i.p. e exposição a ar) e VEH (animais receberam salina i.p e exposição a ar). Ao final do período de exposição (PN44-45), durante um curto período de retirada das drogas (PN49-50) e fase adulta (PN74-75) esses animais foram submetidos ao teste comportamental da Esquiva Passiva, que avalia memória/aprendizado. No primeiro dia de teste (PN44/ PN49/ PN74), os animais são colocados sobre uma plataforma e espera-se até 3 minutos para que desçam sendo administrado um choque (0,3 mA, 3 segundos). 3hrs (T3) e 24hrs (T24) depois, o mesmo ocorre porém, sem a administração do choque. A latência para descer da plataforma foi utilizada como índice de memória/aprendizado. Após o último teste, os animais são sacrificados e os cérebros coletados para a análise posterior. Para identificar efeitos das drogas no sistema colinérgico central avaliamos a atividade da colina acetiltransferase (ChAT); ligação do [3H]hemicholinium-3 (HC-3) ao transportador pré-sináptico de colina e a atividade da acetilcolinesterase (AChE) no hipocampo. Observamos que durante a exposição, os animais dos grupos ETAN, FUM e FUM+ETAN apresentaram menor latência para descer da plataforma em T3, o que também foi observado em T24 nos grupos FUM e FUM+ETAN. No curto período de retirada, em T24 verificamos que camundongos machos FUM+ETAN apresentaram menor tempo de latência para descer da plataforma. Na fase adulta, não encontramos diferenças significativas em nenhuma das sessões de teste. A exposição às drogas não provocou alteração na ChAT, HC-3 e AChE. A atividade da AChE não sofreu alteração nos outros dois momentos analisados. Fêmeas do grupo FUM apresentaram menor atividade da ChAT após cinco dias de retirada das drogas, enquanto que na fase adulta, a redução da atividade foi observada nos grupos FUM, ETAN e FUM+ETAN. Em relação ao HC-3, no curto período de retirada, machos FUM+ETAN apresentaram maior ligação do mesmo ao transportador de colina, mesmo efeito observado na fase adulta em animais machos e fêmeas dos grupos ETAN e FUM. Assim, fumaça de cigarro, etanol e a exposição combinada durante a adolescência de camundongos afetam negativamente a performance no teste de memória/aprendizado de Esquiva Passiva, e, de forma independente, os marcadores colinérgicos analisados.

Há um extenso número de evidências apontando para o estresse como tendo um papel crítico na iniciação, manutenção e relapso após a retirada, do hábito do tabagismo. De modo geral, adolescentes são mais sensíveis aos efeitos no sistema nervoso central de ambos estresse e nicotina, principal componente psicoativo do cigarro. No entanto, há uma escassez de estudos em neurobiologia básica que avaliem as possíveis interações entre os efeitos no sistema nervoso central entre nicotina e estresse nesta idade. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da exposição à nicotina e estresse durante a adolescência de camundongos em comportamentos sociais e comportamentos associados a ansiedade e depressão. Para este estudo utilizamos camundongos Suíços de ambos os sexos. A partir do 30º dia pós-natal (PN) camundongos foram expostos à nicotina (até PN40) e/ou estresse (até PN38 para os animais avaliados em PN39-40 e PN40 para os animais avaliados nas outras idades). Desta forma, utilizamos quatro grupos experimentais: 1) Exposição concomitante de solução de nicotina (diluida na água potável, 50µg/ml) e estresse por contenção (1h/dia); 2) Exposição somente à nicotina via oral; 3) Exposição somente ao estresse por contenção; 4) Grupo controle. Para a avaliação comportamental utilizamos: o teste do labirinto em cruz elevado (LCE), o teste de abordagem social de três câmaras (TS) e o teste do nado forçado (FST). Cada animal foi avaliado nos três testes, em um entre três momentos: ao final do período de exposição (PN39/40), após um curto período a partir do término da exposição (PN44/45) ou na vida adulta (PN69/70). A exposição ao estresse promoveu menor ganho de massa corporal durante a adolescência, sendo o consumo de nicotina incapaz de alterar este parâmetro. Além disso, o estresse não afetou o consumo da solução de nicotina. Nosso modelo não foi capaz de alterar os parâmetros de ansiedade avaliados pelo teste do LCE. Entretanto, a exposição de estresse em concomitância com nicotina gerou hiperatividade ao final do período de exposição em ambos os sexos. Na avaliação do TS e do FST observamos alterações significativas somente após período de retirada. Após um curto período de abstinência pela nicotina, fêmeas apresentaram aumento do comportamento associado à depressão, tendo este efeito sido revertido pela exposição concomitante ao estresse. De forma contrária, na mesma idade, somente a exposição combinada promoveu aumento do comportamento associado à depressão em machos. Além disso, nossos resultados sugerem um aumento de sociabilidade no grupo submetido a exposição combinada após longo período de interrupção da exposição durante a vida adulta. O presente trabalho fornece evidências experimentais que indicam que nicotina e estresse interagem durante a adolescência resultando em alterações na resposta emocional durante o período de exposição e tardiamente, após a sua interrupção causando alterações que perduram até o início da vida adulta.

Metabólitos ativos da cafeína apresentam toxicidade, podendo causar efeitos deletérios em muitos órgãos no período fetal pelo consumo materno. O estudo objetivou avaliar o papel da administração de cafeína durante a gestação em vários parâmetros importantes para a função testicular em camundongos adultos C57BL/6. Fêmeas grávidas foram divididas em: grupo controle (C), que receberam injeções de sol. salina (0,9% NaCl) e grupo cafeína (CF), que receberam diariamente injeções subcutâneas de 20 mg / kg de cafeína. Filhotes tiveram livre acesso à ração padrão desde o desmame até três meses de idade, quando foram mortos. O grupo CF apresentou uma redução no consumo alimentar (C = 4,36 ± 0,14; CF = 3,79 ± 0,05/g, p<0,05) e ganho de massa corporal (C = 25,73 ± 0,14; CF = 21,08 ± 0,41/g, p=0,0001). Ainda este grupo, apresentou alterações estruturais nos testículos da prole, como redução no peso relativo (C = 0,078 ± 0,003; CF = 0,063 ± 0,002/g, p=0,002), diâmetro tubular (C = 455,4 ± 2,7; CF = 393,5 ± 3,1/µm, p=0,0001), lume tubular (C = 310,6 ± 2,5; CF = 254,8 ± 2,9/µm², p=0.0001) e altura do epitélio seminífero (C = 144,8 ± 0,9; CF = 138,7 ± 1,3/µm, p=0,0005) observados pela técnica de morfometria. Testosterona sérica avaliada por quimioluminescência foi reduzida (C = 6,6 ± 2,8; CF = 0,5 ± 0,2/ng/ml, p=0.04). Western Blotting foi utilizado para análise de expressão protéica. Houve aumento do receptor de leptina (C = 0,81 ± 0,04; CF = 1,28 ± 0,15/µg, p=0,01), do receptor para o hormônio leteinizante (C = 0,92 ± 0,05; CF = 0,74 ± 0,05/µg, p=0,01),da aromatase (C = 0,32 ± 0,03; CF = 0,48 ± 0,05/µg, p=0,03) e do regulador pró apoptose (C = 0,27 ± 0,02; CF = 0,42 ± 0,03/µg, p=0,01) enquanto o receptor para hormônio folículo estimulante (FSHR) (C = 0,76 ± 0,06; CF = 0,56 ± 0,04/µg, p=0,02), o receptor para proteína reguladora da esteroidogênese (C = 1,009 ± 0,065; CF = 0,584 ± 0,060/µg, p=0,0007), a proteína do fator de crescimento vascular endotelial (C = 0,33 ± 0,08; CF = 0,05 ± 0,01/µg, p=0,009), o receptor de androgênio (C = 0,97 ± 0,11; CF = 0,59 ± 0,07/µg, p=0,02) e o antígeno nuclear de proliferação celular (C = 0,93 ± 0,11; CF = 0,48 ± 0,07/µg, p=0,01) foram reduzidos. Este estudo sugere que o consumo de cafeína durante a gravidez parece ser nocivo à fertilidade de animais machos, caracterizando o fenômeno de programação, o que gera alterações funcionais e estruturais nos testículos da prole adulta.