Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) was first described in 1958. COMT is a monomeric enzyme magnesium dependent that is involved in the inactivation of catechol substrates such as dopamine, epinephrine and norepinephrine. COMT is an important target in protein engineering due to their role in normal brain and their possible role in human neurological disorders such as Parkinson's, schizophrenia, depression and Alzheimer's disease. Actually, the most effective treatment for Parkinson’s disease is a triple prophylaxis consisting of the dopamine replacement with levodopa together with an inhibitor of aromatic amino acid decarboxylase and an inhibitor of COMT. In recent years, several COMT inhibitors have been developed for Parkinson's disease treatment, and there is considerable interest in developing new and more effective inhibitors. To do so, two points should be taken into consideration. Firstly, although large quantities of COMT can nowadays be produced through biotechnological processes, is still difficult to maintain the protein in a stable and active state mainly in a more pure state, like that achieved after a chromatographic step. There is no fast way to get active protein unless all the process since the production or (in case of frozen cells) since the lyses was done. To overcome this limitation, in this work, a lyophilization process applied to a purified immobilized-metal affinity chromatograph (IMAC) COMT fraction was study with the objective to store or transporting this fractions more easily and for longer periods. The second aspect to take into account concerns the inhibitors of COMT produced. With the number of new inhibitors being produced, is important to study their interactions with the protein. The microcalorimetric technics appears as a good means to kinetically characterize these interactions. So, also in this work, is discussed an initially approach to establish an isothermal titration calorimetry (ITC) method to study interactions between the COMT enzyme and the 3,5-dinitrocatechol (3,5-DNC) inhibitor.

As vacinas, são ferramentas indispensáveis no combate a doenças, que sem a existência destas seriam altamente letais. Com o avanço do conhecimento científico, diferentes tipos de vacinas foram desenvolvidos, sempre com o objetivo de proteger o ser humano e alguns animais de diversas patologias que foram surgindo ao longo da história. Mais recentemente, a comunidade científica, tem olhado para os ácidos nucleicos, nomeadamente para o RNA mensageiro (mRNA), como uma aposta segura e eficaz na entrega do antigénio de interesse, como é discutido no Capítulo I da dissertação. Com o aparecimento de novos vírus, como foi o caso do vírus respiratório responsável pela COVID-19, o SARS-CoV-2, o qual se disseminou por todo o mundo, foi necessário o desenvolvimento de uma vacina capaz de desacelerar o avanço epidemiológico e diminuir o número de internamentos e morte de pessoas infetadas. A tecnologia do mRNA como molécula codificadora do antigénio, aliado à formulação de nanopartículas lipídicas, levou à elaboração de duas vacinas, uma criada pela Moderna e outra pela Pfizer/BioNTech. Estas vacinas provaram ser eficazes e seguras, no entanto, quanto à sua conservação e transporte, as mesmas, teriam de ser transportadas em cadeia ultrafria, o que nem sempre é possível ou viável, quando se trata de um meio com elevadas condicionantes económicas. Por isso, e com vista a melhorar a estabilidade térmica do mRNA foram estudados vários métodos onde essa estabilidade pudesse ser assegurada. Pensou-se em fazer algumas alterações na estrutura física e química do RNA, reformular as partículas lipídicas de modo a diminuir a água presente no núcleo da nanopartícula, e por fim, o freeze-drying ou a liofilização. Concluiu-se que a liofilização é a alternativa mais eficaz e segura de melhorar a termoestabilidade do mRNA, pois não só o complexo LNP/mRNA não sofre alteração significativa de tamanho e forma durante o processo de freeze-drying, mas também a conservação pode ser feita a uma temperatura de 4 °C, sem haver a necessidade de uma cadeia ultrafria. Com isto, o alcance deste tipo de vacinas poderá vir a ser superior, mais económico e com menor constrangimento logístico, levando a um melhoramento da qualidade de vida e saúde da população global. O Capítulo II é o resultado do estágio realizado em Farmácia Comunitária, que decorreu na Farmácia Moderna, na cidade da Guarda, no período de 22 de fevereiro a 1 de julho de 2021, sob a orientação da Dr.ª Ana Raquel Andrade. Neste capítulo encontra-se descrita toda a minha experiência profissional, desde o funcionamento da farmácia à apresentação das tarefas e atividades desempenhadas ao longo deste período.

A indústria farmacêutica tem implementado práticas para atender requisitos regulatórios e certificar-se que os consumidores tenham produtos com qualidade, segurança e eficácia. Uma das mais recentes práticas é a utilização do conceito de Quality by Design (QbD), em português "Qualidade baseada no Projeto", onde a qualidade do produto e do processo pode ser planejada desde o seu desenvolvimento evitando, assim, a maioria das não conformidades e problemas relacionados com a falta do planejamento dos limites de aceitação dos parâmetros de qualidade. No entanto, existe a preocupação de aplicar os princípios de QbD a sistemas e produtos existentes. Aliado a peculiaridade da indústria biofarmacêutica de utilização da operação unitária de liofilização nos seus processos de estabilização de medicamentos de origem biológica e, uma vez que os guias de qualidade não abordam a utilização dos conceitos de QbD em produtos já comercializados, este trabalho tem como objetivo propor uma metodologia utilizando estes conceitos de forma retrospectiva a partir de um banco de dados robusto para a vacina contra sarampo, caxumba e rubéola que se encontra no mercado. Para tal, ao invés de se desenhar o processo a partir do desenvolvimento do produto como preconizam os guias de qualidade internacionais, se utilizou uma base histórica de informações de um processo de produção, seus resultados e suas não conformidades, de ferramentas de análise de risco e de análises estatísticas utilizando como estudo a vacina tríplice viral. Com isto, foi possível propor uma metodologia para o mapeamento de parâmetros críticos, modos de falha e riscos, realizar correlações através da criação do espaço de projeto em cada etapa da operação unitária de liofilização e por fim, melhorar o rendimento dos lotes produtivos. Com a geração de maior conhecimento do produto e do processo a partir da metodologia é possível prever riscos através de uma base de conhecimento científico, assegurando a agências regulatórias que o produtor possui amplo conhecimento e controle das atividades desta operação unitária e que possa assegurar, ao consumidor final, produtos com a qualidade requerida.

A liofilização - ou secagem a frio (freeze drying em inglês) - é um complexo processo multiestágios, onde o produto é primeiramente congelado e sua secagem feita através de sublimação. Devido a esta forma de secagem a liofilização se torna um processo atrativo particularmente importante para a estabilização de componentes orgânicos hidratados e lábeis, de origem biológica. O processo de liofilização é amplamente empregado na indústria farmacêutica, porém em termos de gestão de processo, deve-se evitar a liofilização a todo custo, pois o processo possui diversas desvantagens como: equipamentos de alto investimento, alta demanda energética, processo que demanda tempos longos e produtos com facilidade de hidratar e frágeis, necessitando ser cuidadosamente embalados e armazenados. Este trabalho tem como objetivo a diminuição do ciclo de liofilização de uma vacina viral e analisar a possibilidade de carregamento desse produto no liofilizador a temperaturas negativas, de forma a possibilitar o aumento de produtividade. Para tal, foram realizados três experimentos com ciclos de liofilização com 17 e 20h a menos que o ciclo de liofilização da vacina comercial. Os experimentos foram realizados com a mesma formulação do lote comercial e utilizando um liofilizador piloto. As modificações foram realizadas nas propriedades físicas do ciclo de liofilização atual (temperatura, pressão e tempo) e na temperatura de carga do produto, sem alteração na formulação da vacina ou embalagem primária. Amostras do produto liofilizado experimental foram analisadas quanto ao seu aspecto, desempenho, umidade residual, potência e termoestabilidade acelerada segundo os Mínimos Requerimentos da Organização Mundial da Saúde. Todos os resultados analisados estiveram dentro das especificações e próximos ou melhores quando comparados aos lotes comerciais de origem

As enzimas são biocatalisadores de grande interesse industrial, pois apresentam vantagens frente aos catalisadores químicos e representam alternativa sustentável aos processos industriais. A β-galactosidase é uma importante enzima, possuindo inúmeras aplicações na indústria de alimentos, dentre as quais, destacam-se a hidrólise da lactose e a síntese de galacto-oligossacarídeos. A levedura Kluyveromyces marxianus é importante fonte de β-galactosidase, a qual quando produzida por este micro-organismo é intracelular. A permeabilização celular é uma técnica alternativa que visa o acesso aos compostos intracelulares sem que seja preciso submeter a célula a drásticos tratamentos. Solventes orgânicos e detergentes são reportados na literatura para permeabilização de células microbianas com bons resultados. Após a obtenção da enzima é necessário o emprego de técnicas para a conservação, que colaborem para a manutenção da atividade enzimática durante o período de armazenamento. Este trabalho teve como objetivo empregar solventes orgânicos e detergentes em diferentes concentrações para a permeabilização de células da levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7082, bem como avaliar o emprego de ultra-congelamento (-86°C) e liofilização como formas de conservação da enzima β-galactosidase nas células permeabilizadas. Os agentes permeabilizantes testados foram: álcool metílico, acetona, isopropanol, etanol, acetato de etila, hexano, Tween 20 e Triton X-100. As concentrações testadas variaram de 20 a 50% (p/v) e 100% para os solventes e de 0,5 a 1,5% (p/v) para os detergentes. Os agentes permeabilizantes foram preparados em tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,0. Os solventes apresentaram melhores resultados de permeabilização que os detergentes testados. O álcool metílico 35% (p/v) foi escolhido como o melhor agente permeabilizante e as células permeabilizadas com esse agente foram submetidas a dois tratamentos de conservação (ultra-congelamento a -86°C e liofilização). Realizou-se o acompanhamento da atividade da enzima antes e após 24 horas dos tratamentos de conservação e a cada 5 dias, durante o período total de 30 dias. A liofilização resultou em perda de mais de 50% da atividade da enzima em 20 dias. Já, o ultra-congelamento proporcionou maior permeabilização das células após 24 horas do tratamento e manutenção da atividade enzimática superior ao valor inicial ao longo de 25 dias. Nas células mantidas congeladas a -86°C em 30 dias notou-se redução de 13,42% da atividade inicial da enzima. Nesse sentido, a permeabilização das células da levedura Kluyveromyces marxianus para obtenção de β-galactosidase foi eficaz. No entanto, maiores estudos a respeito dos métodos de conservação da enzima em células permeabilizadas, são necessários de forma a viabilizar o seu uso industrialmente.

Determination of moisture content in lyophilized solids is fundamental to predict quality and stability of freeze-dried products, but conventional methods are time-consuming, invasive and destructive. The aim of this study was to develop and optimize a fast, inexpensive, noninvasive and nondestructive method for determination of moisture content in lyophilized mannitol, based on an NIR micro-spectrometer instead of a conventional NIR spectrometer. Measurements of lyophilized mannitol were performed through the bottom of rotating glass vials by means of a reflectance probe. The root mean standard error of prediction (RMSEP) and the correlation coefficient (R²pred), yielded by the pre-treatments and calibration method proposed, was 0.233% (w/w) and 0.994, respectively.

The aim of the present study was to develop an olanzapine freeze-dried tablet (FDT). The solubility and dissolution rate of poorly water-soluble olanzapine was improved by preparing a freeze-dried tablet of olanzapine using the freeze-drying technique . The FDT was prepared by dispersing the drug in an aqueous solution of highly water-soluble carrier materials consisting of gelatin, glycine, and sorbitol. The mixture was poured in to the pockets of blister packs and then was subjected to freezing and lyophilisation. The FDT was characterised by DSC, XRD and SEM and was evaluated for saturation solubility and dissolution. The samples were stored in a stability chamber to investigate their physical stability. Results obtained by DSC and X-ray were analysed and showed the crystalline state of olanzapine in FDT transformation to the amorphous state during the formation of FDT. Scanning electron microscope (SEM) results suggest reduction in olanzapine particle size. The solubility of olanzapine from the FDT was observed to be nearly four and a half times greater than the pure drug. Results obtained from dissolution studies showed that olanzapine FDT significantly improved the dissolution rate of the drug compared with the physical mixture (PM) and the pure drug. More than 90% of olanzapine in FDT dissolved within 5 minutes, compared to only 19.78% of olanzapine pure drug dissolved over the course of 60 minutes. In a stability test, the release profile of the FDT was unchanged, as compared to the freshly prepared FDT after 90 days of storing.

O cloridrato de diltiazem é bloqueador do canal de cálcio geralmente indicado para o tratamento de angina e de hipertensão e é extensamente biotransformado devido ao metabolismo hepático. A formulação do cloridrato de diltiazem em orodispersão pode prover rápida liberação com maior biodisponibilidade. O sabor amargo do fármaco deve ser mascarado para ser formulado em forma palatável. No presente trabalho tentou-se mascarar o sabor pela técnica de complexação, com uma orodispersão, usando superdesintegrantes, como Doshio P544, crospivodina (CP) e glicolato de amido sódico (SSG). Os complexos de cloridrato de diltiazem com β-CD (razão molar 1:1) foram preparados por mistura, coevaporação, comoagem, liofilização e métodos de fusão. A solubilidade de fase mostrou estabilidade constante de 819,13 M-1. Os complexos de inclusão preparados foram avaliados com relação ao mascaramento do sabor e caracterizados por IV, Difração de Raios X e DSC. Empregando-se o fármaco complexado com β-CD, prepararam-se comprimidos dispersíveis e avaliaram-se os mesmos quanto à dureza, friabilidade, variação de peso, espessura, tempo de desintegração (DT), taxa de dissolução e sabor. Formulações com 4% de Doshion, 8% de CP e 4% de SSG mostraram DT de 0,54, 0,35 e 1,23 minutos, respectivamente.