Desde 1934, quando Moldovan criou o primeiro instrumento que poderia ser descrito como um citómetro de fluxo, este equipamento tornou-se um importante componente em várias especialidades dentro do laboratório clínico para o diagnóstico, prognóstico e monitorização de um número incontável de doenças. Esta tecnologia biofísica suspende entidades biológicas num fluxo de fluido, sinalizando-as usando reconhecimento biomolecular, para depois as detetar através de um aparelho de detecção eletrónica. Com o crescimento das técnicas de fabricação de semicondutores e microfluídos, foram e continuam a ser feitas muitas tentativas de criar citómetros de fluxo do tipo Lab-on-a-Chip (LOC), o que certamente irá afastar os equipamentos usados hoje me dia nos laboratórios por equipamentos usados in situ de custo e tamanho reduzidos, portáteis e sem necessidade de pessoal especializado. Após uma revisão bibliográfica das técnicas e princípios de funcionamento dos equipamentos já existentes foi possível perceber que a utilização de partículas magnéticas (PM) pode ter várias vantagens quando comparadas com o uso convencional de deteção por fluorescência, removendo assim a necessidade de integrar e alinhar componentes ópticos, permitindo uma medição direta e a construção de um citómetro de fluxo LOC com preparação, separação e deteção de amostras totalmente magnético. No INESC-MN foi feito um protótipo que permite a deteção de um tipo de PMs em tempo real a velocidades da ordem de cm/s usando sensores magnetoresistivos integrados em canais microfluídicos mas a primeira demonstração desta técnica para aplicações de citómetro foi realizada através da detecção de células Kg1-a marcadas com PMs de 50 nm que passaram, através de um canal microfluídico, sobre 3 sensores magnetoresistivos demonstrando que, para amostras de elevada concentração, pode ter a mesma eficiência que um hemocitómetro, mas com menor erro. Tendo como ambição um dispositivo LOC capaz de contar várias entidades biológicas na mesma amostra, um módulo de contagem com vários canais paralelos é necessário. Nesse sentido, foi projetado um novo chip com 4 colunas separadas por 3 mm, cada uma com 7 sensores do tipo válvula de spin (SV) com uma área de deteção de 100x4 μm2 distanciados 150 μm uns dos outros. Os sensores são abordados individualmente por uma linha de corrente de alumínio de 300 nm e passivados com 300 nm de nitreto de silicio. Alinhados com as colunas de sensores, 4 canais de polydimethylsiloxane (PDMS) com uma secção de 20 μm de altura e 100 μm de largura foram irreversivelmente colados ao chip por ultravioleta-ozono (UVO) criando o canal onde a amostra irá fluir. Para que as PMs sinalizem a sua passagem é necessário colocá-las sob um campo magnético forte o suficiente para induzir a sua magnetização e para que, consequentemente, as PMs emanem um campo marginal significativo. Aproveitando a insensibilidade das SVs às componentes perpendiculares ao seu plano (xy), aplica-se um campo magnético nesse sentido (z) para magnetizar as partículas. As PMs ao passarem sobre o sensor geraram um sinal bipolar devido ao campo marginal criado pela sua magnetização perpendicular. Como é apresentado na simulação do sinal, a amplitude do mesmo depende apenas da altura da partícula em relação ao sensor e da magnetização das mesmas, idealmente, uma saturação da magnetização das partículas e o máximo de proximidade aos sensores geraria a maior amplitude possível. O campo magnético perpendicular foi criado usando um magnete de neodímio posicionado sob a placa de circuito impresso (PCB), onde o chip do citómetro é colado e as ligações entre o chip e a PCB soldadas por ultrassons com fio de alumínio. Na abordagem usada em Loureiro et al., 2011, um magnete de 20 mm x 10 mm x 1 mm foi simplesmente colado sob a PCB, mas devido aos campos magnéticos serem sempre fechados as componentes x e y criam desvios nas curvas de transferência dos sensores deixando apenas 1 ou 2 sensores de uma coluna do chip operacionais. Numa abordagem seguinte foi usado um magnete 20 mm x 20 mm x 3 mm distanciado 2 cm abaixo da PCB, isto tornou as curvas de transferência dos sensores adequadas para medição, mas fez com que a componente z do campo magnético não fosse grande o suficiente para que as PMs emanassem um campo magnético suficientemente forte. Percebendo as falhas de cada uma das configurações anteriores, foram feitas simulações do campo magnético que iria influenciar o chip originado por magnetes de vários tamanhos a várias distancias para perceber qual conseguiria fornecer uma maior área em que as componentes x e y fossem menores que 10 Oe e em que a componente z fosse de pelo menos 1 kOe. Através das simulações foi concluído que o magnete de 20 mm x 10 mm x 1 mm o mais próximo possível do chip seria a melhor solução, mas que um alinhamento preciso seria necessário. Para esse fim, foi fabricado numa fresadora um sistema de alinhamento em PMMA. Para que o alinhamento fosse o correto foram feitos 4 furos de alinhamento no sistema de PMMA e na PCB e para reduzir a distancia ao máximo foi feita uma bolsa na PCB da mesma área que o chip deixando a distancia do magnete aos sensores de 1 mm (0.3 mm de PCB + 0.7 mm de substrato de silício). Com isto, o alinhamento em x foi conseguido, mas para alinhar em y foi criado um trilho no sistema de PMMA onde o magnete pudesse deslizar, controlando-o pela rotação de um parafuso com passo de 0.5 mm. Para colocar o magnete na posição ideal, foi medida consecutivamente a curva de transferência do 4º sensor de uma das colunas, num campo magnético de -141 Oe a 141 Oe, até que este tivesse um campo de acoplamento efectivo (Hf) de aproximadamente 0 Oe, o que significa que a curva de transferência estaria perfeitamente centrada em zero e criaria um sinal bipolar perfeito. Após o alinhamento e posicionamento do magnete, todos os sensores foram caracterizados e, nesses resultados, podemos ver perfeitamente o efeito das componentes x e y do magnete. Com o lado longo do magnete paralelo ao lado longo das SVs e alinhado de forma que o Hf fosse o mais próximo de 0 Oe no 4º sensor de uma coluna, percebemos que a componente x (lado longo) do campo magnético criado pelo magnete tem efeitos na sensibilidade dos sensores fazendo com que esta caia à medida que nos afastamos do centro do magnete. Enquanto que a componente y tem efeitos sobre o Hf dos sensores tornando-o mais positivo à medida que medimos a 3ª, 2ª e 1ª linha de sensores e tornando-o mais negativo quando medimos a 5ª, 6ª e 7ª linha. São também apresentadas simulações dos canais microfluídicos para perceber como a velocidade das partículas afeta o sinal e qual a velocidade máxima permitida para que placa de aquisição eletrónica seja capaz de o detetar. Com estas conclusões, um novo chip foi desenhado e fabricado. Neste novo chip a distância entre as colunas de SVs foi reduzida para apenas 1 mm, o que obrigou também à alteração dos canais microfluídicos, ao tamanho do chip e da estrutura de PDMS. Também são apresentadas simulações que mostram que se um segundo magnete, alinhado com o primeiro, for colocado sobre os canais microfluídicos poderá melhorar a magnetização e a homogeneidade do campo, o que permitirá que os 4 canais tenham a mesma sensibilidade e um desvio padrão de Hf menor. Todos os antecedentes teóricos, os métodos de microfabricação e técnicas de caracterização usados são apresentados e descritos.

[Excerpt] Introduction Miniaturization has played a pivotal role in driving innovation in microfluidic devices, particularly in their application across advanced technologies, such as Lab-on-chip platforms, Point-of-care systems, Organ-, Body- and Disease-on-a-chip technology. The personalized nature inherent in these systems, coupled with physiologically relevant readouts, opens novel avenues for individualized disease diagnostics, Figure 1. Additionally, they offer personalized strategies for assessing treatment efficacy and safety. Furthermore, the advancement in micro- and nano-microfluidic fabrication allows parallel analysis of large samples sets and the evaluation of different parameters such as biological molecules, cells or drugs.[...]

Nowadays, the prototypes of microfluidic systems are generally produced via micromilling of thermoplastic polymethyl meth-acrylate (PMMA). The main limitations are the design of micro tools with diameters D ≤ 50 μm adapted for each application, and the understanding of the machining process itself. The objective of this research work is to contribute to mastering the process of PMMA micromilling with tool diameters D ≤ 50 μm on a 3-axes precision milling machine. For this purpose, the process design must include the complete process chain—from the CAD/CAM data up to the final structure geometry. The main requirements are the manufacture of microfluidic structures with Ra < 60 nm on the groove bottom and a top burr overhang h0 < 3 μm. Based on the experimental results, milling parameters were established and the influence of the tool geometry on the burr formation was determined. Finally, CAD/CAM machining strategies were recommended

Classic biopsies are largely used for cancer diagnosis, which are often an invasive procedure. Alternatively, circulating tumour DNA in the blood can be used as liquid biopsy. For DNA amplification, digital polymer- ase chain reaction (dPCR) is becoming the selected procedure for extremely sensitive quantification of nu- cleic acid molecules. Droplet-based microfluidic platforms are widely used in dPCR, since microfluidics allows the efficient partitioning of samples in nanolitre-sized droplets, using oil-water interfaces, which sta- tistically results in one or zero DNA strand target molecule per droplet prior to amplification, showing a positive or negative fluorescent signal during amplification. In the present thesis, it is proposed a novel dPCR detection technique using a miniaturized fluorescence microscope, UCLA Miniscope, integrated in a droplet generator microfluidic device. The Miniscope was developed for neuroscience research due to its portability and lightweight, to be carried by small animals. This fluorescence detection technique is straight- forward, miniaturized, and inexpensive. To assess fluorescence detection sensitivity by the Miniscope, sev- eral fluorescein isothiocyanate (FITC) solutions were tested, with concentrations ranging from 1 nM to 100 μM, and the lowest concentration to present a detectable fluorescence intensity was 1 μM. Moreover, posi- tive and non-template-control PCR mixes of the cancer biomarker c-Myc after end-point amplification con- taining fluorescent DNA-binding dye EvaGreen were tested, and it was possible to discriminate the positive droplets and the non-template-control droplets. This research opens new prospects for the advancement of improved lab-on-a-chip methods designed for dPCR analysis and for further biological and medical applica- tions.

In the first few months of the project the CENIMAT partner concentrate their work in the optimization of the microfabrication in SU-8, to make masters for PDMS microchannels and grooves for insertion of optical fibers. SU-8, a negative photoresist, is one of the most used materials in the fabrication of microfluidics, mainly due to its transparency, mechanical, chemical and thermal stability. However, SU-8 is very sensitive to process parameters and the high aspect ratio features are difficult to obtain duo to large internal SU-8 stress that may lead to SU-8 peeling. In the optimization process we were able to fabricate high aspect ratio narrow structures (~ 10µm) with high vertical side-walls (130µm) necessary to insert the fibers and fabricate focusing lenses. The FSCOSD partner in conjunction with CENIMAT concentrated their efforts in the design of detection chamber, which involves optical lenses microfabricated in SU-8. The distances curvature and dimensions of the optical detection chamber play a crucial role in the detection process, so a careful planning and modeling was necessary. This process is now is the step of mask design for photo lithography. The IPC major concern in this initial part of the project was related with conceiving design that allows evaluating the mixing of the fluids inside the channels. Once the channels are microfabricated the mixing will the evaluated through Fluorescent Microscopy.

The advancement of organ-on-a-chip (OoC), as end-use preclinical tool, has been slackened with the techno logical and engineering challenges that in-situ real-time monitoring of physicochemical and biological param eters still represent. In this study, the envisioned solution to surpass this challenge is the integration of a microneedle (MN) patch into a microfluidic device to collect cell culture media directly from the organ chamber and drive it to a module envisioned to contain the biosensing system for real-time monitoring. For that, porous MNs (PMNs) were fabricated using a polydimethylsiloxane (PDMS) bulk material, casted with one of two ma terials, one organic and one inorganic, which were explored to create micropores after removal processes. The developed PMN arrays were characterized regarding their mechanical, wettability, permeability and porosity properties. Then, the selected PMN patch, with the best combined properties to serve as media collector was integrated into a proof-of-concept microfluidic system and the system validated through albumin optical ab sorption analysis. The findings of this study highlight the potential to use PMN patches in advanced microfluidic platforms to simplify the integration of biosensor systems, and thus, with high potential of applicability in biomedical research and preclinical diagnostic tools.

Potato cyst nematodes (PCN), Globodera rostochiensis and G. pallida, are quarantine organisms which are subjected to stringent regulatory measures when detected. The incidence of PCN in Portugal is quite high and both species are present in all regions. Detections were mostly due to G. rostochiensis, but recently the situation has reversed. The overuse of potato cultivars resistant to G. rostochiensis led to a decline of this species population densities, but had no effect on G. pallida, which continued its reproduction without restrictions, since it doesn’t have effective resistant cultivars, being now the most detected species. Thus, breeding of commercially attractive cultivars targeting resistance to G. pallida (with different R-genes), should be a priority. Aiming a rapid detection, a Loop-mediated-isothermal-amplification (LAMP) G. pallida specific assay was developed. The primers designed for LAMP amplification specifically detected G. pallida, even in samples mixed with other species. Because LAMP requires cheaper equipment due to its isothermal amplification and all steps are conducted within one reaction-tube, it clearly holds potential for on-site detections. Modern agriculture uses sensor to provide accurate data on crop growth. Therefore, specific DNA-probe and PCR-primers were designed to be used in a magnetoresistive-biosensing-device developed at INESC-MN to detect G. pallida. The device receives the target PCR-products (further labelled with magnetic-nanoparticles), which hybridize with the probe immobilized on the sensor surface, being detected due to a variation in the electrical resistance of the sensor. To improve the on-site detection, the combination of the magnetoresistive-biosensing-device with an easy DNA extraction method (FTA-cards) and a rapid DNA isothermal-amplification (LAMP) was tested. These three technologies allowed the detection of G. pallida with a detection limit of one juvenile, even when mixed with other species. FTA-LAMP based biosensors show great potential for rapid in-field detections or at border phytosanitary inspection. Thus, this work provides insights for a new strategy to construct advanced devices for in-field diagnostics of plant pests/pathogens; - GLOBOWARNING - MITIGAÇÃO DE SURTOS DE GLOBODERA Spp. EM PORTUGAL ATRAVÉS DE UM SISTEMA INOVADOR DE NANO-DETEÇÃO PRECOCE E BIOCONTROLO RESUMO: Os nemátodos-de-quisto da batateira (NQB), Globodera rostochiensis e G. pallida, são organismos de quarentena, sujeitos a medidas regulatórias quando são detetados. A incidência de NQB em Portugal é bastante elevada, estando já presentes em todas as regiões. As deteções eram principalmente de G. rostochiensis, mas recentemente a situação alterou-se. A utilização de cultivares de batata resistentes a G. rostochiensis levou ao seu controlo populacional, não afetando G. pallida, que continuou a reproduzir-se por não haver cultivares totalmente resistentes a esta espécie, sendo agora a espécie mais detetada. Assim, o melhoramento de cultivares comercialmente atraentes e resistentes a G. pallida (com diferentes R-genes) deve ser prioritário. Ambicionando uma rápida deteção, foi desenvolvido um método de amplificação isotérmica de DNA (LAMP) para G. pallida. Os primers-LAMP desenhados detetaram especificamente G. pallida, mesmo em amostras com juvenis de outras espécies. Como o LAMP requer equipamentos menos dispendiosos, devido à amplificação isotérmica, e as etapas poderem ser conduzidas num único tubo, possui grande potencial para deteções in loco. Na agricultura moderna já se utilizam sensores para obter dados precisos sobre o desenvolvimento das culturas. Assim, foram desenhados primers-PCR e uma sonda, específicos para G. pallida, para serem testados num protótipo com biossensores-magnetorresistivos, desenvolvido no INESC-MN. Neste dispositivo, os produtos-PCR (posteriormente marcados com nanopartículas-magnéticas), hibridam com a sonda imobilizada na superfície do sensor, sendo detetados devido a uma variação na resistência elétrica do sensor. Para aperfeiçoar a deteção in loco de G. pallida, foi testada a combinação da utilização de cartões FTA para extração de DNA, com o método LAMP e o protótipo do INESC-MN. Estas tecnologias permitiram a deteção de G. pallida mesmo em amostras com um juvenil ou em misturas com outras espécies. Os biossensores associados com FTA-LAMP mostram-se promissores para deteções no campo ou nos postos de controlo de inspeção fitossanitária. Este trabalho fornece assim novas estratégias para diagnóstico in loco de pragas/doenças das plantas.

This work deals with the production of a low-cost disposable biosensor for point of care applications. The proposed sensor is a plasmonic structure based on the Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) interaction of metal nanoparticles (MNPs), embedded into a matrix of reduced Graphene Oxide (rGO). After proper functionalization with selective antibodies (Ab), the efficiency of light extinction is controlled by slight changes of the refractive coefficient induced by the concentration of biomarkers trapped by the antibodies on the sensor surface. This work reports a study about the applicability of rGO as a support for gold nanoparticles (AuNPs) for preparing the functionalized LSPR sensing layer. AuNPs are prepared with an economic and eco-friendly method using phytochemicals present in tea extract at room temperature, while a modified Hummer’s method is used to synthesize rGO. The resulting AuNPs-rGO composites are studied in terms of UV-VIS spectroscopy spectral light transmission and plasmonic resonance. The overall analysis is supported by simulation results, obtained by Mie analysis, about the LSPR effect in AuNPs-rGO and its dependence on the biomarker concentration.