ABSTRACT - THE ROLE OF IL-12 IN THE PATHOGENESIS OF ENDOMETROSIS IN MARE - Equine endometrosis is a chronic degenerative uterine condition. It is characterized by fibrotic processes developing around the endometrial glands and stroma, in which the involved processes can be active or inactive. The severity of endometrial fibrosis is graded according to four categories: Category I (no fibrosis), followed by IIA, IIB, and III, which indicate mild, moderate, and severe fibrosis and inflammation. Endometrosis is a significant contributor to mare infertility, resulting in financial loss for horse owners globally, including those in Portugal. Although the pathogenesis of endometrosis is multifactorial, our study specifically investigated the potential role of interleukin (IL)-12. In a recent study, which focused on transcriptomic profiling of mare endometrium, changes in the expression of genes associated with interleukin (IL)-12 signaling and production in fibroblasts at different stages of endometriosis were demonstrated, identifying IL-12 as a potential player in the development of endometrial fibrosis. Interleukin 12 is a proinflammatory cytokine synthesized and released by macrophages, monocytes, dendritic cells, and B cells that participates in both cellular and humoral immune responses. This cytokine is composed of two covalently linked subunits (IL-12a(p35) and IL-12b(p40)). The purpose of the current study was to: (i) evaluate the mRNA expression of IL-12 subunits (IL-12p35, IL-12p40) and its receptors (IL-12RBeta1 e IL-12RBeta2), in mare endometria (n=77) from categories I, IIA, IIB, and III at the mid-luteal phase (MLP) and follicular phase (FP) of the estrous cycle; as well as (ii) the effect of IL-12 on the mRNA expression of fibrotic markers, such as: collagen COL1A1 and COL3A1, fibronectin (FN1), lysyl oxidase like 2 (LOXL2), α-smooth muscle actin (α-SMA), matrix metalloproteinases (MMP) 2, 3 and 9, and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)1 and 2 in endometrial fibroblasts (n=6); and (iii) the effect of IL-12 on fibroblast proliferation (n=6). Real-time PCR was performed on endometrial samples to determine mRNA expression of IL-12 components and receptors. The transcriptional evaluation of fibrotic markers was performed by qPCR in endometrial explants after the treatment with IL-12 (10 ng/ml) for 48 and 96h. In Category IIB endometria, the mRNA expression of IL-12RBeta2 was up-regulated in the MLP, compared to FP of the estrous cycle, and IL-12 treatment increased COL1A1, COL3A1,Alfa-SMA, MMP3, and -9 mRNA expression in mare endometrial fibroblasts cultured in vitro after 96h (p<0.05). Moreover, fibroblast proliferation was decreased in response to IL-12 treatment after 96h (P<0.001). The findings from the current study indicate that IL-12 has a direct impact on the expression of fibrotic markers in endometrial fibroblasts and fibroblast proliferation. It suggests a correlation between IL-12 and endometrosis development through the increased ECM components and MMP expression associated with fibrogenesis

We have previously reported that mouse plasmacytoid dendritic cells (DC) produce high levels of IL-12p70, whereas bone marrow-derived myeloid DC and splenic DC produce substantially lower levels of this cytokine when activated with the TLR-9 ligand CpG. We now show that in response to CpG stimulation, high levels of IL-10 are secreted by macrophages, intermediate levels by myeloid DC, but no detectable IL-10 is secreted by plasmacytoid DC. MyD88-dependent TLR signals (TLR4, 7, 9 ligation), Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor-dependent TLR signals (TLR3, 4 ligation) as well as non-TLR signals (CD40 ligation) induced macrophages and myeloid DC to produce IL-10 in addition to proinflammatory cytokines. IL-12p70 expression in response to CpG was suppressed by endogenous IL-10 in macrophages, in myeloid DC, and to an even greater extent in splenic CD8alpha(-) and CD8alpha(+) DC. Although plasmacytoid DC did not produce IL-10 upon stimulation, addition of this cytokine exogenously suppressed their production of IL-12, TNF, and IFN-alpha, showing trans but not autocrine regulation of these cytokines by IL-10 in plasmacytoid DC.

Introdução: Inúmeras células da resposta imune são envolvidas durante uma resposta antitumoral efetiva, dentre elas, linfócitos T citotóxicos e T auxiliares (Th). Vários estudos demonstram que a regressão tumoral é dependente da produção de IL-12, tanto em situações espontâneas ou quando o paciente é submetido a algum tipo de imunoterapia. Recentemente, foi descrito um novo subtipo de Th, o Th12, que está presente em humanos e animais com tumores. Contudo, sua função e a interação desse subtipo na resposta antitumoral ainda não estão claras. Portanto, neste estudo, assumimos como objetivo esclarecer se a imunoterapia de pacientes com células dendríticas, poderia alterar a quantidade desse novo subtipo, bem como investigar quais outras citocinas, além da IL-12, estariam sendo produzidas por esses linfócitos, como a interleucina-2 (IL-2), interferon-ɣ (IFN-ɣ), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-10 (IL-10). Metodologia: Para a análise deste trabalho, quinze pacientes oncológicos foram submetidos à imunoterapia com CDs e os linfócitos do sangue periférico foram avaliados antes e após as duas primeiras imunoterapias. Resultados: Como resultados, verificou-se que em mulheres com câncer, a célula CD4+/IL-12+ apresentou a %GATE aumentada (*** p<0.0001) e a MFI (média de intensidade de fluorescência) diminuída (***p=0,0002) e as citocinas IFN-γ (**p=0,0093) e IL-2 (***p= 0,0010) apresentaram a MFI diminuída. Durante as fases da imunoterapia, a IL-12 apresentou uma diminuição na sua %GATE (*p= 0,0312). Conclusão: Mulheres com câncer invasivo apresentam níveis aumentados de linfócitos T auxiliares IL-12 e as duas primeiras imunoterapias com CDs induziram uma diminuição da diferenciação desse tipo celular.

No contexto tumoral, o sistema imunológico desempenha papeis que podem prevenir o desenvolvimento ou a progressão tumoral. Assim, a produção de citocinas, principalmente por linfócitos T CD4+, representa um fenômeno crucial na resposta imune, uma vez que variações nesta regulação podem resultar em uma resposta inadequada. Anteriormente, esse grupo de pesquisa demonstrou que linfócitos T CD4+ de pacientes com estádios avançados de câncer expressavam interleucina-12, o mesmo se aplicando a camundongos induzidos a câncer de mama com DMBA (7, 12 – Dimetilbenzantraceno). Então, o objetivo do presente estudo foi avaliar a síntese de IL-12 em linfócitos T CD4+ do sangue periférico de pacientes com câncer, correlacionando com a expressão dos fatores de transcrição T-bet, GATA-3, RORγt e FoxP3, utilizando citometria de fluxo e abordagens moleculares. As células T CD3+CD4+IL-12+ foram isoladas a partir do sangue periférico obtido de pacientes com câncer, utilizando técnica de citometria de fluxo com princípio de cell sorting (triagem de células) e submetidas a análise do perfil transcricional. Os resultados demonstram uma porcentagem significativamente maior de linfócitos T CD3+CD4+IL-12+ no sangue periférico de pacientes com câncer (p<0,0001). E estas expressam o fator de transcrição RORγt, podendo ainda algumas coexpressarem o fator T-bet. Ainda foi observado que algum fator (s) sérico (s) presente no soro dos pacientes com câncer são capazes ainda de induzir a diferenciação de linfócitos T CD3+CD4+IL-12+, sendo notável o aumento na porcentagem destas células em culturas estimuladas com o soro (p=0,0020). Entretanto novas investigações são necessárias, para compreender esse fenótipo de linfócito.

INTRODUÇÃO: De papel indispensável, as células dendríticas, importantes apresentadoras de antígeno com heterogeneidade fenotípica e funcional, ligam as respostas imunes inatas e adaptativas. São responsáveis pela regulação e modulação de respostas efetoras contra microrganismos e células tumorais, também realizam a manutenção da tolerância imunológica em condições homeostáticas. Sua plasticidade funciona de acordo com estímulos e microambiente em que estão inseridas. A imunoterapia utilizando essas células, está em constante estudo para a obtenção de ativação suficiente de uma resposta imune celular. Vários protocolos e patentes foram e ainda são testados para diferenciação e maturação de um perfil apropriado de células dendríticas para uma imunoterapia eficaz. OBJETIVO: Testar o perfil de ativação e migração apresentado pela cultura de células dendríticas submetida a maturação por diferentes protocolos de estímulos (TNF-α e TNF-α, IL-12 e CCL5) em ensaio in vitro. METODOLOGIA: Sangue periférico de voluntários saudáveis (n=10) foi utilizado para o isolamento de monócitos e linfócitos. As células aderentes foram diferenciadas em células dendríticas que foram submetidas a maturação por 2 diferentes protocolos (protocolo 1 com estímulo de TNF-α; protocolo 2 referente a estimulação com TNF-α, IL-12 e CCL5) e posteriormente co-cultura com células não aderentes. Para a caracterização do perfil fenotípico das células totais (aderentes e não aderentes), foi analisada a intensidade média de fluorescência de marcadores de superfície (CD209, CD11c, HLA-DR, CD123, CD209, CD80, CD86, CD83, CD3, CD8, CD4, CD25, FOX-P3, NKG2D e CD54) e citocinas (granzimas, perforinas, IL-10, IFN γ, TNF-α, IL-12, TGF-β, IL-4 e IL-17), por citometria de fluxo. A migração das células dendríticas maturadas foi vista sobre coloração e contagem de células em membrana de poliestireno submetidas a cultura com um gradiente quimiotático (MCP-1 e CCL5). RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os resultados mostram aumentos significativos na expressão de moléculas de adesão/co-estimulatórias CD209, CD11c, HLA-DR, CD123, CD80, CD86, CD83 e citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-12, IL-10 e TGF-β) das células dendríticas do protocolo 2 comparado com o protocolo 1. De tal forma, vemos a ativação de subtipos importantes de células T (Th1 e Th17, com redução de Treg) e Natural Killer (NK) produtoras de IFN-γ, com expressão diminuída de IL-10 no mesmo protocolo. CONCLUSÃO: Nossos estudos indicam que o protocolo de estimulação com TNF-α, IL-12 e CCL5 foi capaz de gerar um perfil de células dendríticas maduras e eficazes para ativação de subtipos balanceados de linfócitos T e células NK, importantes na resposta imune antitumoral.

O objetivo do presente estudo foi comparar a produção de IFN-γ, IL-12 e IL-4 entre camundongos jovens (5, 12 e 19 dias de idade) e adultos (30 dias de idade). As avaliações foram feitas por estimulação, in vitro, de células esplênicas com Concanavalina A (ConA) , Staphylococcus aureus (S. aureus) e lipopolissacarídeo (LPS). Diferentes concentrações de cada estímulo foram testadas e os sobrenadantes das culturas foram coletados após 48 horas de incubação e as concentrações de IFN-γ, IL-12 e IL-4 determinadas por ELISA. Células de camundongos jovens e adultos produziram níveis igualmente elevados de IFN-γ após estímulo com ConA. Somente animais adultos produziram IFN-γ em resposta ao estímulo com S. aureus. Em culturas estimuladas com LPS, a produção desta citocina foi baixa e similar nos animais jovens e significativamente elevada nos animais adultos. Somente células de animais adultos estimuladas com S. aureus foram capazes de produzir IL-12. O único estímulo capaz de induzir níveis detectáveis de IL-4 foi ConA, sendo que estes níveis foram mais elevados nos animais com 12 e 19 dias de idade em comparação com animais neonatos e adultos. A diminuição das doses ótimas dos estímulos não mudou o perfil de produção de cada citocina nos animais jovens. Estes resultados permitem concluir que a idade afeta a produção de citocinas: ocorre maior produção de IL-4 em camundongos jovens e maior produção de IL-12 e IFN-γ em animais adultos. Estas informações são importantes devido ao papel destas citocinas na polarização das respostas imunes nos sentidos Th1 e Th2. Palavras-chave: camundongo; citocina; interferon-gama; interleucina-4; interleucina-12.