Introdução: A diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença de etiologia multifatorial com lesão das células beta do pâncreas. Constitui uma das doenças crónicas mais frequentes na infância e adolescência, tendo a sua incidência aumentado nas últimas décadas. No momento do diagnóstico, a maioria dos indivíduos apresenta função residual das células beta, quantificada através do peptídeo-C. Esta patologia leva à deficiente produção de insulina, hiperglicémia e aumento do risco de desenvolvimento de complicações vasculares. Atualmente a terapia existente consiste na administração exógena de insulina com esquemas complexos e na adoção de estilos de vida saudáveis. Objetivo: O objetivo desta monografia foi apresentar o estado da evidência atual sobre as terapias imunomediadas em DM1 e demonstrar se há possibilidade de oferecer novos tratamentos, mais especificamente com terapias imunossupressoras, com vista à preservação da função das células beta e adiamento da insulinoterapia intensiva. Material e Métodos: O presente trabalho teve como base a pesquisa bibliográfica de artigos científicos na base de dados “PubMed/MEDLINE” com uso das palavras-chaves “type 1 diabetes” e “preservation”. A pesquisa foi limitada a ensaios clínicos randomizados, por estes fornecerem informação com maior validade e grau de evidência, representando o tipo de estudo mais fidedigno, comparativamente com estudos observacionais ou em animais. A pesquisa foi completada através da consulta de documentos de entidades científicas e livros da área abrangida pela tese. Resultados: Este trabalho identificou 22 artigos que estudaram várias abordagens para a preservação das células beta e da secreção de peptídeo-C na prevenção de complicações e possível remissão da doença em indivíduos com diagnóstico recente. Os ensaios analisados fazem referência a terapias imunossupressoras no âmbito da prevenção terciária. As abordagens são variadas e visam a imunidade inata ou adaptativa, a modulação da resposta dos linfócitos B ou das células T. Nalguns estudos verificou-se que existem resultados promissores, no entanto a maioria dos ensaios clínicos não obteve resultados consistentes para serem aplicados na prática clínica. Discussão: A falta de uma metodologia e critérios rigorosos para a elaboração de ensaios clínicos na área da DM1 limitou os resultados. Embora algumas terapias tenham alcançado a preservação da secreção do peptídeo-C, esta é geralmente transitória e com o aparecimento de eventos adversos. Conclusão: No futuro, será importante dar continuidade à investigação desta temática, com metodologias e critérios rigorosos, incluindo também estudos pré-clínicos. Atualmente existem modelos pré-clínicos, murganhos diabéticos não obesos, desenvolvidos no âmbito da prevenção primária e secundária e que constituirão novas direções para a investigação.

No presente relatório são descritas as atividades realizadas durante os oito meses do estágio curricular realizado no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (CHUC), no âmbito do Mestrado em Ciências Biomédicas da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior. O estágio abrangeu as principais valências de um laboratório de análises clínicas: a Hematologia, Imunologia, Microbiologia e Bioquímica. Este relatório foca, essencialmente, as metodologias características de cada um destes setores e os parâmetros analíticos mais solicitados na rotina de um laboratório hospitalar. De modo a evidenciar a importância do diagnóstico laboratorial, tendo em conta os vários setores do laboratório de patologia clínica, foi incluído no presente relatório um estudo de caso de um doente com Mieloma Múltiplo. O estágio foi uma experiência enriquecedora e permitiu-me adquirir competências científicas relativas à execução de técnicas analíticas utilizadas nas diferentes áreas do laboratório de patologia clínica.

A epidemiologia da hanseníase tem demonstrado a utilização de ferramentas clínicas, moleculares e imunológicas, para o mapeamento dos principais focos de ocorrência da doenças e de áreas de alto risco de adoecimento. Programas de controle da hanseníase, doença de longo período de incubação, em que os contatos são os principais grupos de risco, devem estabelecer todos os procedimentos disponíveis para o controle desse agravo. Objetiva-se estudar aspectos epidemiológicos clínicos e imunológicos da hanseníase em município hiperendêmico do Maranhão. Estudo de epidemiológico descritivo, realizado com 599 contatos, entre outubro de 2009 a outubro de 2011, no Serviço de Dermatologia no ambulatório do Hospital Universitário da Universidade Federal do Maranhão unidade Presidente Dutra São Luís - MA. Foi observado que a maioria dos contatos foi do gênero feminino com 57,17%, a faixa etária predominante acima de 15 anos, ou seja, (64,59%) com maior frequência na faixa de 20 a 59 anos, idade adulta e produtiva e o tipo de convívio predominante é o intradomiciliar com 74,95%, a forma clínica foi HT (30,00%), a classificação operacional mais frequente foi a MB com 61,90% do gênero feminino; a maioria apresentou somente uma cicatriz vacinal pela BCG, destacou-se o gênero masculino com 63,00%. O teste Elisa apresentou percentual de 63,50% e o ML-Flow 64,00%. Considerando o resultado dos testes Elisa e ML-FLOW sugere-se a utilização das técnicas imunológicas como ferramentas necessárias para o diagnóstico precoce, controle e vigilância dos contatos como forma de interromper a cadeia de transmissão da hanseníase na cidade pesquisada.

Existe actualmente grande indefinição e controvérsia relativamente à demarcação de populações linfocitárias do sangue periférico humano que resultam fundamentalmente de pequenas divergências de protocolos utilizados em diferentes laboratórios. Foi dentro deste âmbito que desenvolvemos estudos com vista à identificação e determinação do grau de intercepção das diferentes populações linfocitárias. Para tal empregámos técnicas comummente utilizadas - testes de marcação simples e de Destituição Celular (DC) - e uma técnica por nós previamente desenvolvida (Carvalho, 1983) de marcação dupla - Reacção de Roseta Mista (RRM). Para identificação de (i) linfócitos B, (ii) linfócitos T, (iii) linfócitos possuidores do antigénio Ia (células Ia⁺) e (iv) linfócitos apresentando a cadeia leve K da imunoglobulina (celulas C⁺) usámos testes de Reacção de Roseta Antiglobulina (ou anti-determinante) Directa - RRAD ou RRAdD - utilizando, respectivamente, (i) imunoglobulina anti-Fab humana, (ii) anticorpo monoclonal (AcMc) contra determinante antigénio presente em linfócitos T humanos, (iii) AcMc contra o antigénio Ia humano e (iv) AcMc contra a cadeia leve K humana. Os linfócitos possuidores de receptores para a porção Fc da IgG foram detectados pela reacção de roseta EA, usando eritrócitos de Boi sensibilizados com anticorpo específico, IgG purificada. Os testes simples indicaram que da população total de linfócitos sanguíneos, 75,1± 5,3% (média± DPM) (n=76) eram células T; 19,4±6,4% (n=97) eram células B; 13,8±6,1% (n=21) expressavam a cadeia K; 15,6±7,6% (n=66) possuíam o antigénio Ia; e 22,6±3,3% (n=21) expressavam 207 receptores para Fcᵧ. Dos testes de marcação dupla pudemos concluir que não existe uma separação perfeita entre linfócitos B e linfócitos T, pois observámos que da totalidade de linfócitos sanguíneos 5,0±3,7% (por DC) ou 3,9±2,7% (por RRM) possuíam ambos os marcadores de linfócitos B e de T. Verificámos também que da totalidade de linfócitos B do sangue periférico, (i) 32,76±22,99% (por DC) ou 22,58±18,26% (por RRM) possuíam o antigénio dos linfócitos T; (ii) 65,96±6,40% (por RRM) eram portadores da cadeia leve K; (iii) 42,27±27,11% (por DC) ou 61,30±24,30% (por RRM) possuíam o antigénio la; e (iv) 74,33±13,00% (porRRM) apresentavam receptores para a porção Fc da IgG. Do mesmo modo, da totalidade de linfócitos T registámos que (i) 6,26±4,42% (por DC) ou 5,28±3,58% (por RRM) possuiam Ig de superfície; (ii) 2,73±2,08% (por RRM) apresentavam a cadeia K; (iii) 4,12±2,36% (por RRM) expressavam o antigénio Ia; e (iv) 6,10±3,09% (por RRM) possuíam receptores Fcᵧ. Com base nos valores obtidos construímos um modelo bidimensional que permite visualizar a interrelação das diversas subpopulações linfocitárias, facilitando assim a interpretação e discussão dos resultados. Observámos alterações nas proporções das subpopulações de linfócitos humanos em culturas in vitro após estimulação mitogénica (fitohemaglutinina, PHA) alogénica (cultura mista de linfócitos, MLC) ou viral (MLC com linfócitos autólogos transformados por vírus Epstein-Barr). O aumento de células Ia⁺ foi apreciável (de <20% atingiram 40-60% da totalidade de linfócitos) e resultou da notável elevação da proporção de linfócitos T que adquiriram o antigénio Ia (de <5% atingjram 50-60% dos linfócitos T). Alterações das subpopulações linfocitárias em doentes receptores de enxerto cardíaco, mantidos sob tratamento imunodepressor, constituiu objecto de estudo pormenorizado. Em doentes que haviam sido submetidos a transplantação há mais de um ano e que recebiam tratamento diário de predenisona e azatioprina, observámos um decréscimo acentuado do número de linfócitos constituintes de cada subpopulação linfocitária tendo sido a população de células T a mais afectada, apresentando uma redução de 90,72% relativamente ao controlo normal. Em termos de valores percentuais a população T sofreu uma redução significativa (56,66±13,02%) em relação ao controlo normal (75,11±5,29%). Pelo contrário, as células TIa⁺ apresentavam-se significativamente mais elevadas (9,16±8,62%) do que em indivíduos normais (3,40±2,20%). A administração de globulina anti-timócito (GAT) aos doentes durante os 10 dias imediatamente após a operação de transplantação, causou um decréscimo ainda mais acentuado do número de células constituintes das diversas subpopulações linfocitárias. Foi também a população T a que sofreu redução mais acentuada em termos percentuais, enquanto que as subpopulações TIa⁺ e TFcᵧ⁺ aumentaram a sua proporção. Em doentes imunodeprimidos com ciclosporina A e predenisona observámos no período de dois a cinco meses após transplantação cardíaca o surgimento de infecções por herpesvírus. Durante a infecção observámos uma redução de linfócitos T e um proporcional aumento de linfócitos B; os elevados níveis de células TIa⁺ encontrados foi devido à elevação da proporção de linfócitos T a expressarem o antigénio Ia. Os picos de células TIa⁺ relacionavam-se com a infecção primária por citomegalovirus ou com a reactivação por vírus Epstein-Barr ou por vírus do herpes simples; aqueles picos formaram-se antes da produção máxima de IgM e IgG anti-viral e sofreram regressão com a administração intravenosa de metilpredenisolona ou transfusão sanguínea. Pelo contrário, a produção de anticorpos não foi sensível a tais tratamentos. Não encontrámos correlação entre o desenvolvimento de células TIa⁺ e a rejeição de enxerto. Estes resultados indicam que o tratamento imunodepressor administrado aos doentes receptores de enxerto cardíaco não impede o desenvolvimento de mecanismos celulares e humorais capazes de superar as infecções por herpesvírus. Do presente estudo podemos concluir que as populações linfocitárias humanas não formam compartimentos perfeitamente estanques, e que o aumento ou redução da expressão de receptores e/ou antigénios, como resultado da resposta imunológica dos linfócitos, evidencia a natureza dinâmica e mutável das populações linfocitárias.

Insects, including Drosophila melanogaster, are able to efficiently recognize invading intruders and to mount a potent and rapid innate immune reponse to both bacterial and fungal infections. In the last decade, the fruit fly has emerged as a promising invertebrate model to investigate innate immunity, in part because of it’s well characterized genetics. The information provided by the inumerous reports on Drosophila’s immune response indicates that a high number of genes are both up- and down-regulated, in addition to the wellknown antimicrobial peptide genes, upon immune challenge. Nevertheless, their contribution in fighting off infection has not been seriously addressed. With the application of recent advances in proteomics, a 2-DE protein map of Drosophila larvae hemolymph was constructed. A total of 105 protein spots were excised and submitted to identification by mass spectrometry, using a combination of MALDI-TOF/TOF MS and MS/MS spectra and resulting in 99 positive identifications. The list of identified protein spots includes metabolic enzymes, structural proteins, translational apparatus components, heat shock proteins and proteins involved in defence mechanisms, such as antioxidant and immunological reactions. The study of their cellular function, as well as enchaining the overall biochemical information, will contribute to a better understanding of the underlying molecular mechanisms of Drosophila’s immune response.

Both mesenchymal stromal cells (MSCs) and human amniotic membrane (hAM) possess immunoregulatory potential, driving several studies to focus on their application in the prevention and treatment of immunological disorders, and especially on their ability to modulate T cell responses. However there is little information regarding the concrete effects over different activation and differentiation stages of T cells. The main objective of this study was to determine whether or not a hAM extract (hAME) had a differential effect over different T cell subpopulations (CD4+ and CD8+ T naïve, central memory, effector memory and effector cells). Thus, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were cultured in the presence or absence of hAME and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) plus ionomycin. Cell proliferation was evaluated through a thymidine incorporation assay and the percentages of pro-inflammatory cytokine producing T cells were determined by flow cytometry. The phenotype of hAM-derived cells was also assessed by flow cytometry. Plus, the mRNA expression of selected genes was evaluated in purified CD4+ and CD8+ T cells, regulatory T cells (Treg) and γδ T cells. The hAM-derived cells contained hAM epithelial cells and MSCs. The extract displayed an antiproliferative effect and reduced the frequency of tumor necrosis factor-alpha (TNFα), interferon gamma (IFNγ), and interleukin-2 (IL-2) producing cells, within all T cell subsets. The hAME also diminished the frequency of IL-17 and IL-9 producing T cells. The pattern of inhibition varied between CD4+ and CD8+ T cells, between T cell subsets, and depending on the cytokine under study. The hAME also produced a decrease in mRNA expression of granzime B, perforin and activating receptor NKG2D by CD8+ T cells, γδ T cells as well as an upregulation of Foxp3 and IL-10 gene expression in CD4+ T cells and an upregulation of IL-10 mRNA expression in Treg cells. These results show that the hAME differentially regulates different T cell subsets and therefore the effect of the hAME over T cells responses will depend on the T cell subpopulations involved. Still, the hAME has an overall antiinflammatory action.