A trombospondina-1 (TSP-1), o primeiro inibidor fisiológico da angiogênese a ser caracterizado em 1990, possui papel controverso na angiogênese tumoral e na metástase. O domínio N-terminal da TSP-1 (NTSP-1) é pró-angiogênico e nossos trabalhos em modelos endoteliais sugerem que ele potencializa a ação de fatores de crescimento (FCs) angiogênicos através de seus receptores tirosina-quinase (RTKs). Dada a importância do N-terminal na interação da TSP-1 com células tumorais, torna-se essencial definir se tais eventos também ocorrem nessas células. Selecionamos as linhagens MCF-10A (hiperplásica), MCF-7 (tumoral; não invasiva) e MDA-MB-231 (tumoral; invasiva), que foram caracterizadas quanto à expressão de receptores para o domínio NTSP-1, com o objetivo de avaliar suas respostas respostas funcionais ao EGF, cujo RTK (EGFR) foi o único consistentemente detectado nas três linhagens mamárias. As células foram tratadas com EGF ou NTSP-1, além de uma combinação de ambos, nos seguintes ensaios funcionais: (i) “wound healing” (migração coletiva); (ii) migração individual; (iii) análise de proliferação e morte celular; (iv) diferenciação em esferoides 3D (exceto MDA-MB-231); (v) ativação de EGFR e de ERK1/2. Mudanças expressivas foram detectadas nos parâmetros individuais de migração de cada linhagem, ressaltando: células MCF-10A e MDA-MB231 tratadas com NTSP-1/EGF exibiram maior distância acumulada, se comparadas com células tratadas com EGF. Nas células MCF-7, os tratamentos com EGF e NTSP-1/EGF induziram as maiores velocidades de migração. A análise de trajetórias, para as três linhagens, sugere que as respostas a NTSP-1 estão relacionadas à aquisição de padrões de migração randômicos, relacionados na literatura ao comportamento metastático. Não foram observadas modificações importantes na homeostase da proliferação e morte celulares nas células MCF-10A e MDA-MB-231, enquanto o tratamento NTSP-1/EGF estimulou a proliferação de células da linhagem MCF-7. A análise das linhagens MCF-10A e MCF-7 em ambiente tridimensional (3D) evidenciou transições morfológicas importantes em ambas, mas apenas nas células MCF-7, o NTSP-1 potencializou a mudança induzida pelo EGF nos esferoides, para fenótipos em cachos e em colar de contas, ambos considerados menos diferenciados e/ou mais migratórios. Investigamos a via canônica RasRafMEKERK1/2, ativada por EGFR. NTSP-1 e EGF não pareceram atuar com sinergismo na ativação do EGFR e de ERK1/2 nas linhagens MCF-10A e MDA-MB-231, mas uma forte tendência de potencialização de ERK1/2 pelo NTSP-1/EGF foi observada na linhagem MCF-7, com redução do nível total de EGFR, sugerindo o aumento da sua endocitose, o que foi confirmado por microscopia confocal, com a observação de persistência da co-localização de EGFR com Rab5A (marcador de endossoma primário) até 60 minutos, apenas com o tratamento NTSP-1/EGF, sugerindo que o NTSP-1 prolonga a ação do EGF nessas células. Ensaios da via de ERK em células MCF-7, nos quais NTSP-1 foi substituído por TSP Hep II, um peptídeo bioativo ligante de sindecan-4, demonstrou tendência de maior ativação da via. Em ensaios clonogênicos, o tratamento com TSP Hep II, isolado ou em combinação com EGF, levou à formação de colônias de menor diâmetro e de aspecto celular disperso. Por fim, caracterizamos a potencialização de outro FC, FGF-2, na resposta angiogênica dependente de FGFR1, em CEs microvasculares. Nossos dados reforçam hipótese de um papel pró-tumoral e pró-angiogênico para domínio N-terminal da TSP-1 presente no microambiente de tumores mamários, em sinergia com FCs

Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STEC) causam doença em humanos e animais. Além de doença diarreica, determinam complicações sistêmicas como síndrome hemolítica urêmica (SHU), púrpura trombótica trombocitopênica ou ainda sequelas como hipertensão arterial e isquemia miocárdica, entre outras. A ampla distribuição de STEC no trato gastrointestinal de uma variedade de animais, particularmente bovinos e outros ruminantes, indica o caráter zoonótico da doença. STEC, além de colonizarem bovinos, podem contaminar alimentos como a carne e o leite e sobreviver no solo, esterco, pastagens e na água, importantes veículos para a sua transmissão. A maioria das cepas STEC invadem enterócitos e podem persistir intracelularmente. Há evidências de que a localização intracelular de STEC constituiria uma estratégia eficiente para a colonização do animal hospedeiro. Alguns patógenos têm a capacidade de explorar as vias endocíticas da célula hospedeira para a sua internalização. Embora muito se saiba quanto aos conteúdos e as estruturas endocíticas, pouco se sabe sobre os mecanismos de endocitose específicos pelos quais estes conteúdos são recrutados e internalizados. No presente estudo foram investigados aspectos da invasão de células Caco-2 por cepas STEC representativas de alguns sorotipos envolvidos em doença humana, como EDL931 (O157:H7), 282/2 (O8:H19) e 784/1 (O113:H21). Foram empregados testes de inibição da invasão bacteriana por drogas que interferem em vias endocíticas (cloridrato de clorpromazina, metil-β-ciclodextrina e filipina ) e imunofluorescência para a detecção de proteínas marcadoras de endossomas precoces (Rab5, EEA-1) endossomas tardios (Rab7) e lisossomos (LAMP1), além da sonda LysoTracker Red DND-99. A clorpromazina foi eficiente na inibição da atividade invasora de todas as cepas STEC, caracterizando o envolvimento da via da clatrina na internalização de STEC, pelo mecanismo de zippering. Para algumas cepas (sorotipos O157:H7 e O113:H21) um segundo mecanismo, via lipid rafts/caveolina pareceu também participar. Todas as cepas mostraram colocalização com os marcadores EEA-1, Rab7 e LAMP1, mas não com Rab5. A colocalização com Rab 7, marcador de endossomas tardios só ocorreu 3 horas pós-infecção, sendo possível que este tempo contribua para retardar a fusão dos fagossomas aos lisossomos, favorecendo a sobrevivência e multiplicação inicial do microrganismo. Entre 1 e 3 horas pós-infecção, apenas parte dos fagossomos contendo STEC demonstrou marcação por LAMP1 e fusão com lisossomos, avaliada pelo uso da sonda LysoTracker Red DND-99. Nesta etapa da infecção foram encontradas numerosas bactérias íntegras em fagossomas não marcados com LAMP-1 ou com a sonda. Já em fase tardia da infecção (48 horas), ocorreu uma redução no número de bactérias intracelulares e apenas uma minoria destas não associada a lisossomos, conservando a sua integridade estrutural. Estes resultados sugerem que uma subpopulação das STEC intracelulares sobrevive e persiste, evitando de alguma forma a sua destruição pelos lisossomas. Tal característica pode ser relevante para a prolongada persistência de STEC no hospedeiro animal.

O gene CFTR (cystic transmenbrane conductance regulator) codifica um canal de cloreto e bicarbonato, presente na membrana apical de células epiteliais. A abundância e função desta glicoproteína é fisiologicamente determinante. Além de promover o equilíbrio iónico nas secreções epiteliais, é essencial para a eliminação de agentes patogénicos, proteção epitelial contra xenobióticos e produtos tóxicos libertados por agentes patogénicos, regulação do pH luminal e pela manutenção da hidratação da superfície epitelial. Deficiências na sua função, causadas por mutações no gene CFTR, estão na base do desenvolvimento da doença autossómica recessiva fibrose quística (CF). Contudo, o défice funcional de CFTR também pode ser adquirido num contexto genético selvagem, pela ação de fatores externos, como a exposição ao fumo do tabaco, álcool, metais pesados, hipoxia e acidose locais, toxinas bacterianas, stress oxidativo e inflamação capazes de comprometer a função ou abundância do canal na superfície celular e promover o desenvolvimento de doenças como a doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), asma, pancreatite aguda e a cólera. Esta glicoproteína é constituída por dois domínios transmembranares (TMD1 e TMD2), dois domínios citoplasmáticos de ligação a nucleótidos (NBD1 e NBD2) e um domínio regulatório central (domínio R). A sua atividade é regulada pela fosforilação do domínio R, que induz a ligação de ATP aos domínios NBD, promovendo a abertura do canal iónico. A síntese da proteína CFTR envolve a translocação da cadeia polipeptídica, proveniente do ribossoma, através da membrana do retículo endoplasmático (ER). Quando esta se encontra no lúmen do ER sofre uma N-glicosilação, que distingue a sua forma imatura com ~150 kDa, designada banda B, em ensaios de Western blot (WB). A CFTR segue o caminho da via secretora desde o ER até ao complexo de Golgi, onde é processada por várias glicosiltransferases (GTFs) de forma a atingir a sua forma madura, com 170-180 kDa, identificada como banda C. Ao atingir a forma madura é armazenada em vesiculas trans-Golgi que promovem a inserção do canal na membrana plasmática (PM). A deslocação destas vesiculas até à PM ocorre através das fibras do citoesqueleto de actina e é facilitada pela miosina Vb (Myo5b), que é recrutada pela GTPase, Rab11. Este transporte até à PM requer a ligação do domínio C-terminal da CFTR com o domínio PDZ da proteína adaptadora NHERF-1 formando um complexo. Quando este complexo é inserido na PM, a adaptadora NHERF-1 interage com a proteína de ancoragem ao citoesqueleto, ezrina, que permite a retenção da CFTR na superfície celular, impedindo a sua endocitose. A endocitose e consequente remoção da CFTR da PM é mediada pela proteína clatrina, e é desencadeada após dissociação do complexo CFTR/NHERF1/ezrina. Sabia-se que a sinalização a jusante da via de proteínas cinase mitogénicas (MAPK) estava envolvida no processo de internalização da CFTR, no entanto, os mecanismos regulatórios que promovem a remoção desta proteína da PM não estavam claros. Em estudos anteriores, o laboratório de acolhimento descreveu um mecanismo em que a quantidade e prevalência de CFTR na PM de células epiteliais brônquicas é regulada através da via de sinalização SYK/SHC-1. Este mecanismo é desencadeado pela fosforilação da CFTR, ancorada na PM, no resíduo de tirosina 512 (Y512), pela tirosina cinase citoplasmática SYK. A fosforilação da CFTR permite o recrutamento e ligação da proteína adaptadora citosólica SHC-1, através do domínio PTB desta última. A proteína SHC-1 possui também um domínio SH2 que a direciona a interagir com recetores fosforilados na PM. Ao interagir com os recetores na PM, a SHC-1 recruta outras proteínas adaptadoras citoplasmáticas, como proteínas da família GRB, e fatores de troca de nucleótidos de guanina (GEFs) da família SOS, por exemplo. Estes GEFs ativam GTPases da família RAS na PM que, por sua vez, ativam cascatas de sinalização, como a via MAPK. Assim, a proteína SHC-1 funciona como um ponto de ligação entre o sinal para a internalização, fornecido pela fosforilação da CFTR pela SYK, e a maquinaria a jusante da via MAPK que promove a remoção do canal da PM, via endocitose mediada pela clatrina. Recentemente, um grupo de investigação da Universidade de Davis (Califórnia, EUA), com o qual o laboratório de acolhimento tem uma colaboração, determinou que o fármaco idebenone (IDE), bem como alguns compostos seus derivados, conseguiam bloquear a interação da SHC-1 com o recetor da insulina (IR) em hepatócitos, interação esta também mediada pelo domínio PTB da SHC-1. Com base nestes dados, postulámos que talvez fosse possível utilizar estes compostos para interferir com a interação da SHC-1 (via domínio PTB) com a CFTR fosforilada pela SYK no resíduo Y512, impedindo assim a sua internalização em células epiteliais brônquicas. Nos estudos em hepatócitos, o tratamento com IDE inibia também a sinalização da via MAPK a jusante do IR, o que a verificar-se nas células epiteliais brônquicas poderia também contribuir para reduzir a internalização da CFTR fosforilada. No entanto, é sabido que esta via de sinalização desempenha um papel fundamental no processo de renovação celular necessário à manutenção da integridade e função do epitélio respiratório. Assim, quisemos também avaliar o grau de compromisso da viabilidade celular que o tratamento com estes fármacos acarretaria. Deste modo, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia dos inibidores recentemente desenvolvidos para a proteína adaptadora SHC-1 na modulação da prevalência de CFTR na PM. Além disso, procurámos compreender o impacto destes inibidores na via de sinalização das MAPK e na viabilidade das células epiteliais. A hipótese central deste estudo postula que os inibidores da SHC-1, nomeadamente o IDE e seus derivados, poderiam modular seletivamente a interação SHC-1/pY512- CFTR e consequentemente reduzir a internalização da CFTR na PM sem comprometer a viabilidade celular. Começámos por avaliar a capacidade dos inibidores, IDE e composto C#3, em elevar os níveis de CFTR na PM através da técnica de biotinilação, que permitiu a marcação seletiva da proteína CFTR presente na superfície celular com uma molécula de biotina após o tratamento com os inibidores, e posteriormente, a sua extração com streptavidin e análise através de WB. Os níveis de fosforilação da proteína ERK (p-ERK) também foram analisados por WB após tratamento com os inibidores, uma vez que são um indicador chave da ativação da via de sinalização MAPK. Seguidamente, realizámos ensaios de MTT para analisar a viabilidade celular nas três linhas celulares em estudo. Ao avaliar a presença de CFTR na membrana verificámos que nas três linhas celulares que utilizámos como modelos experimentais, CFBE-CFTR, 16HBE e Caco-2, nenhum dos inibidores, IDE e composto C#3, conseguiram bloquear de forma seletiva e significativa a internalização do canal. Este resultado sugere que o efeito do IDE pode ser somente específico para a interação entre a SHC-1 e o domínio NPEY fosforilado do IR, não afetando a interação da SHC-1 com outras proteínas fosforiladas, como a CFTR. Um outro resultado que apoia a especificidade dos inibidores para a interação SHC-1/IR e a incapacidade de modular a via de sinalização das MAPK, é a ausência de efeito significativo de ambos os inibidores nos níveis de p-ERK. A incapacidade de ambos os inibidores em modular eficazmente a via de sinalização das MAPK é ainda destacada pelo impacto reduzido na viabilidade das três linhas celulares em estudo, revelado pelo MTT. Notavelmente, o tratamento com IDE à concentração de 10 µM induziu uma redução significativa na viabilidade às 24 h especificamente nas células CFBE-CFTR, o que não foi replicado pelo composto C#3 em nenhuma concentração ou tempo. A comparação deste efeito com o do selumetinib e com os níveis de p-ERK1/2, sugere uma especificidade desta linha celular e da dose, possivelmente resultante do processo clonal de seleção, para o efeito do IDE. Além disso, nas células 16HBE, o composto C#3 pareceu aumentar ligeiramente os níveis de p-ERK nas concentrações mais baixas do fármaco. Esta observação está de acordo com a literatura, que sugere que as respostas ao tratamento com IDE e os seus derivados podem variar em diferentes contextos celulares. Em suma, o conjunto dos nossos resultados não apoiam a nossa hipótese inicial, levantando questões sobre a adequação do IDE e do composto C#3 como inibidores da SHC-1 fora do contexto da interação SHC-1/IR nos hepatócitos. Uma perspetiva futura seria desenvolver uma metodologia de triagem semelhante à utilizada por Tomilov et al. (2018), utilizando péptidos específicos para CFTR para revelar compostos capazes de interferir seletivamente com a interação SHC-1/pY512-CFTR, e consequentemente promover o aumento da prevalência do canal na PM. Esta abordagem permitiria ainda compreender os possíveis efeitos destes compostos no tratamento de doenças, em que tanto a função da CFTR como a via de sinalização MAPK estão desreguladas, e minimizá-los, permitindo o desenvolvimento de terapias mais específicas e eficazes.

The development of multicellular organisms, as well as the maintenance of adult tissue homeostasis, requires the production of new cell types that will build up the new organism and maintain it throughout its entire life. Cell proliferation, differentiation and cell death have to be carefully orchestrated during development, requiring cell-cell communication. This is carried out by a small number of cell signaling pathways that are reiteratively employed both during development and during tissue homeostasis in adults. One of these pathways, which plays many critical roles, both during development and in adult stem cells, is the Notch signaling pathway. During my PhD, I become interested in understanding how different cell types can be specified during development, and how do cells ensure that this occurs properly. During the first part of my thesis, I investigated one mechanism of cell type specification – asymmetric cell division. During the second part of my PhD, I studied the maintenance of tissue homeostasis by the adult stem cells of the Drosophila ntestine. During development, multipotent cells divide and give rise to cells with more restricted fates, in the process of building differentiated adult tissues. One mechanism employed to specify different cell fates is asymmetric cell division: during mitosis, cell fate determinants are asymmetrically localized to one of the future daughter cells, and will determine the fate of that daughter cell (Knoblich, 2001). A good example of this occurs during the development of the sensory organs in Drosophila, where precursor cells, the sensory organ precursors (SOPs), divide asymmetrically to produce two distinct cells, a pIIa cell and a pIIb cell. These will again divide asymmetrically to give rise to the four different cell types of the sensory organs. In this process, the Par6-aPKC complex localizes at the posterior cortex of the SOPs and promotes the actin-dependent localization of the cell fate determinants Numb, Partner of Numb (Pon) and Neuralized to the opposite anterior pole. Both Numb and Neuralized regulate Notch signaling, promoting its activation only in the posterior cell, which will become the pIIa cell (Bardin et al., 2004). The plasma membrane lipid phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PIP2) regulates the plasma vi membrane localization and activity of various proteins, including several actin regulators, thereby modulating actin-based processes (Di Paolo and De Camilli, 2006). I examined the distribution of PIP2 and of the PIP2-producing kinase Skittles (Sktl) in mitotic SOPs, and found that both Sktl and PIP2 reporters were uniformly distributed in dividing SOPs. However, in the course of this study, I unexpectedly observed that overexpression of full-length Pon or its localization domain (LD) fused to the Red Fluorescent Protein (RFP:PonLD) resulted in asymmetric distribution of Sktl and PIP2 reporters in dividing SOPs. This finding that Pon overexpression alters polar protein distribution is important because RFP::PonLD is often used as a polarity marker of dividing progenitors (Perdigoto et al., 2008). However, since Sktl and PIP2 do not play any detectable role in the asymmetric localization of the cell fate determinants, I decided to not further pursue this project. The second part of my PhD focused on how adult stem cells maintain tissue homeostasis. The maintenance of adult tissue homeostasis during the whole life span of the organism (which in some vertebrates can be more 200 years) requires that stem cells divide to replace the differentiated cell types of the organ, as well as to maintain the stem cell pool. In order to do so, adult stem cells utilize many of the same signaling pathways that are employed during embryonic development to regulate cell growth, proliferation, differentiation, death and morphogenesis. The adult Drosophila Intestinal Stem Cells (ISC) divide throughout the lifetime of the adult fly to replenish gut tissue by producing two differentiated cell types. The ISC division is thought to be asymmetric concerning the fate of the two daughter cells: one remains an ISC and the other becomes a progenitor cell, termed the enteroblast (EB). The ISC is the only dividing cell in the adult gut, and the EBs go on to differentiate directly, either into an enterocyte or an enteroendocrine cell. Enterocytes are polyploid absorptive epithelial cells, while the enteroendocrine cells are diploid cells that express peptide hormones. Lineage labeling analysis demonstrated that ISCs are multipotent stem cells (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006) and Notch signaling has been shown to play a role in regulating cell fate decision of the ISC lineage. The Notch ligand Delta is expressed in the ISCs and Notch signaling is activated in the EB to promote EB, enteroendocrine and vii enterocyte fates (Micchelli and Perrimon, 2006; Ohlstein and Spradling, 2006; Ohlstein and Spradling, 2007). In my work, I have shown that the transcriptional repression of Notch target genes is required to maintain the ISC identity (Bardin et al., 2010). However, how Notch signaling is modulated to control the acquisition of the EB fate and two distinct differentiated cell fates is not understood. It has been proposed that the specification of the differentiated fates could be related to the level of Notch signaling (Ohlstein and Spradling, 2007), a mechanism that has also been proposed to be employed by other stem cell lineages (Mazzone et al., 2010). Given the role of Notch signaling in many stem cell fate decisions, it is important to understand how it can promote alternative fates in a single precursor cell. To answer this question and to identify novel regulators of the cell fate decisions in the ISC lineage, we carried out a chemical mutagenesis screen in Drosophila. During this screen, random mutations were induced and mitotic clones, in the F2 generation, were screened for mutants in which intestinal cell type specification was affected. Several complementation groups with defects in cell type specification were identified, which can be divided into three groups: mutants in which the stem cell is lost, mutants with overproduction of enteroendocrine like cells and mutants with excess of stem cell-like cells. I characterized briefly and mapped some of these mutations. I further investigated the role of one of the genes identified in this screen. One complementation group was found to specifically affect the self-renewing of ISCs without affecting the production of differentiated cells. I mapped this complementation group to the Gmd (GDP-mannose 4,6-dehydratase) gene. Clones of Gmd mutant cells have an overproduction of Delta positive, proliferative, multipotent stem cell-like cells in the intestine. However, unlike the loss of Notch signaling, loss of Gmd does not affect differentiation, as shown by the finding that enterocytes and enteroendocrine cells are normally specified in Gmd mutant clones. This suggests that in Gmd mutants ISCs, the ISC can divide asymmetrically, in relation to the fate of the daughter cells, to self-renew and produce EBs, or symmetrically to give rise to two ISCs. Gmd is required for the production of fucose and has been shown to be required for the O-fucosyltransferase 1 (Ofut1)-dependent fucosylation of the Notch viii receptor (Okajima and Irvine, 2002; Okajima et al., 2003; Sasamura et al., 2003). It is thought that O-fucosylated Notch protein serves only as a subsequent substrate for further glycosylation by the glycosyltransferase Fringe (Fng), since the loss of fucosylation results in defects only in developmental contexts that require Fngdependent modification of Notch (Okajima et al., 2008; Okajima et al., 2005). Interestingly, I found that Gmd plays a fringe-independent, but Ofut1-dependent, role to limit symmetric ISC divisions. Furthermore, the Gmd phenotype can be suppressed by the expression of active nuclear Notch. In addition, I found that Notch signaling could still be activated in Gmd mutant clones, but that precise asymmetric fate decisions in the daughter cells do not occur. Studies in mammalian cells found that O-fucosylated Notch receptor is more strongly activated by its ligands (Chen et al., 2001; Moloney et al., 2000; Stahl et al., 2008). My data are consistent with Gmd being required for high levels of Notch activation in the ISC lineage, which is necessary to limit symmetric division of the ISC. To test how the levels of Notch signaling affect the ISC lineage, I analyzed the temperature-dependent effect of rumi mutations in the intestine. Rumi is a component of the Notch signaling pathway but the requirement for Rumi is temperature-dependent: at 18ºC rumi mutants have a very mild loss of Notch signaling phenotype while at 28ºC they have a stronger phenotype (Acar et al., 2008). I found that rumi mutant clones in the intestine are wild-type at 18ºC but have a stronger phenotype at 28ºC. At 21ºC and 22ºC, rumi mutant clones have an overabundance of ISCs but differentiation is essentially unaffected, similar to Gmd mutants. This data support a model in which different cell fate decisions require different levels of Notch signaling: while the asymmetric decision between ISC and EB requires high levels of Notch signaling, further differentiation of the EB into enterocyte or enteroendocrine cells can occur with lower levels of Notch activity. Such requirement of high levels of Notch signaling for daughter cell commitment, that is, exit from self-renewal, could be a mechanism to prevent loss of the ISC. I propose that this could be a general mechanism utilized by stem cells to ensure their maintenance, in which high threshold signaling prevents noisy, low levels of signaling that could lead to the loss of the stem cell.

The work described throughout this thesis was focused in the study of crotaminederived peptides’ (NrTPs) mechanism of action. Also, and due to the cell-penetrating nature of these molecules, we emphasized the importance of its use as drug delivery adjuvants. The different peptides used were designed to address important mechanistic questions. In Chapter 2 we describe experiments carried out using lipid membrane model systems. We studied the interaction, partition and extent of membrane penetration of NrTPs using large unilamellar vesicles (LUV). We prepared POPC, POPG, POPC:POPG and POPC:Cholesterol LUV and studied them by fluorescence spectroscopy techniques. Also, we conducted translocation assays for NrTP1 and NrTP5 using giant multilamellar vesicles (GMLV) and giant multivesicular liposomes (GMVL). In these experiments, conducted by confocal microscopy (and later for flow cytometry studies too), we used rhodamine B-labeled NrTPs. In Chapter 3, we describe the experiments that tested peptide’s uptake into mammalian cells. In these studies, carried out using fluorescence microscopy or flow cytometry, we evaluated the ability of NrTPs to be internalized into different types of cells, using different peptide concentrations and at different incubation temperatures. We used immortalized cells lines (BHK21, HeLa, BV-173 and MOLT-4) and primary cells (mainly PBMCs). Also, we assessed NrTPs cytotoxicity in different cell models and determined the kinetic profiles for their uptake into PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) along with tests to unravel the internalization mechanism. In Chapter 4, we describe a very important proof-of-concept experiment: the test for NrTPs’ ability to carry and delivery a large molecule into cells. We prepared conjugates of NrTP6 covalently linked (maleimide-based chemistry) to β-galactosidase (β-gal). Conjugates were tested for their enzymatic activity in vitro and after incubated with HeLa cells. β-gal activity in the cell free extract after conjugate incubation was used as readout of the efficient cellular entry. Throughout this project we used different techniques, methodologies and models. Our key conclusions are: NrTPs interact and translocate across membrane model systems. They are successfully internalized into mammalian cells without compromising cell viability. Cytotoxicity is peptide- and concentration-dependent and the signs of cytotoxicity appeared only for the higher concentrations tested. The kinetic uptake profiles are cell-type dependent, concentration-independent and significantly different among NrTPs. The internalization inhibition at 4°C and in the presence of dynasore (dynamin inhibitor) is different among NrTPs, leading as to conclude that both endocytosis and direct translocation play a role in cell internalization of NrTPs. Still, endocytosis was the predominant mechanism. The methodology employed to follow and analyze the uptake of NrTPs using flow cytometry is a valuable comparative and quantitative method to test CPP efficiency among different peptides. NrTPs are responsible for cargo entry. They are able to deliver large molecules such as proteins (β-gal) that are then still able to perform their biological activity. The take home message: NrTP6 is an efficient tool for intracellular delivery!

Several links between endocytosis and the maintenance of mitochondrial structure and function have been reported, yet they are poorly understood. Endocytic proteins, such as membrane curvature sensor endophilin B, GTPases dynamin-2 and dynamin-related protein-1 (Drp1), are necessary for proper mitochondrial function. Moreover, inhibitors of clathrin mediated endocytosis, endosidin9 and tyrosine kinase inhibitor tyrphostin A23, uncouple mitochondrial oxidative phosphorylation. The main goal of this work was to explore effects of impaired endocytosis using the mammalian model without key endocytic proteins, endophilin-A or phosphatase synaptojanin-1, on mitochondrial function. Statistical analysis of Next Generation Sequencing (NGS) data indicates that knock-out of endophilin-A, or synaptojanin-1, leads to a downregulation of transcript levels of genes encoding mitochondrial proteins. Mitochondrial malfunction was identified based on the following criteria: reduced membrane potential, decreased oxygen consumption rate and elevated reactive oxygen species production. The glycolytic pathway has also been affected in both mutants. Moreover, increased lysosomal mass and diminished proteolytic activity were observed, which are characteristic of lysosomal dysfunction. Functional iron deficiency was detected in endophilin-A triple knock-out, which most likely contributes to observed mitochondrial malfunction since iron is a crucial cofactor in various biological processes, such as oxygen transport, cellular respiration and mTORC1 signalling. Notably, mTOR pathway regulates iron metabolism and homeostasis: PI3K/AKT/mTOR pathway was found significantly affected by knock-out of endophilin-A (activities of AKT and mTOR are reduced). Abnormal activity of PI3K/AKT/mTOR pathway may have multiple consequences since mTOR signalling coordinates key aspects of metabolism at both the cellular and organismal level. Proper mTOR activity is also necessary for regulation of protein synthesis, autophagy and critical neurological processes. Overall, endophilin-A and synaptojanin-1 are necessary for proper mitochondrial and lysosomal function, and lack of endophilin-A leads to functional iron deficiency and significantly decreased activity of PI3K/AKT/mTOR pathway.

A Doença de Alzheimer (DA) é a maior causa de demência na população idosa. Esta doença é caracterizada por uma perda progressiva de memória e funções cognitivas, que resultam da perda sináptica e neuronal. As duas maiores características histológicas da DA são as placas neuríticas extracelulares constituídas por Péptido Beta Amilóide (Aβ) e as tranças neurofibrilares formadas por tau hiperfosforilada. A formação de Aβ por proteólise da Proteína Precursora Amilóide (APP) através da via amiloidogénica é o passo crucial no desenvolvimento da DA. O processamento amiloidogénico da APP resulta de uma clivagem inicial mediada pela Enzima de Clivagem da APP no sítio β 1 (BACE1) seguida de uma clivagem mediada pela γ-secretase. Assim, a BACE1 foi identificada como um possível alvo de intervenção terapêutica na DA visto que a sua inibição irá impedir a formação de Aβ em consequência do processamento da APP. Resultados prévios revelaram que o novo inibidor da BACE1 Péptido-x (PEPx), desenvolvido pela nossa equipa no Centro de Neurociências e Biologia Celular, reduz os níveis de Aβ40, Aβ42 e de APP β Solúvel (sAPPβ), outro produto da clivagem da APP pela BACE1. De forma a compreender mais profundamente os mecanismos de captação celular do PEPx, bem como os efeitos da inibição da BACE1 em vários eventos neurológicos subjacentes à neurodegeneração na DA, investigámos a captação endocítica do composto in vitro e avaliámos in vivo num modelo animal da DA, os Murganhos Triplo Transgénicos (3xTg-DA), os efeitos de um tratamento crónico relativamente à perda sináptica, neuroinflamação e morte celular. Neste trabalho, usando a linha celular Neuro-2a (N2a) avaliámos por microscopia de fluorescência em células vivas a captação celular por via endocítica do PEPx marcado com um fluoróforo usando uma solução hipertónica de sacarose, um inibidor de amplo espectro da endocitose, e a Clorpromazina (CPZ), um inibidor farmacológico da endocitose mediada por clatrina. Por outro lado, os estudos in vivo foram realizados em murganhos 3xTg-DA tratados diariamente (injecção i.p.) com solução salina ou com PEPx durante 4 meses. Murganhos Não Transgénicos (Non Tg) da mesma idade e da mesma estirpe foram usados como controlo das vias patogénicas que os murganhos 3xTg-DA desenvolvem de forma dependente da idade. Nós observámos que, nas células N2a, o PEPx internalizado se distribuiu em estruturas citoplasmáticas de aparência vesicular. A internalização em estruturas vesiculares foi inibida na presença de uma concentração elevada de sacarose e pela CPZ, sugerindo que o PEPx é internalizado essencialmente por endocitose mediada por clatrina. In vivo, o tratamento crónico com PEPx levou ao aumento dos níveis de SYP em murganhos 3xTg-DA. Visto que a SYP não sofreu alteração em murganhos 3xTg-DA com 8.5 meses tratados com solução salina em comparação com os murganhos Non Tg, os efeitos do tratamento com PEPx sugerem um ganho sináptico. Em relação à neuroinflamação, o inibidor da BACE1 diminuiu os níveis de NLRP3 em murganhos 3xTg-DA, sugerindo uma diminuição da formação do inflamossoma. Os níveis de NLRP3 em murganhos Non Tg não foram detectáveis. Concluindo, estes resultados sugerem que a inibição do processamento da APP, para além de uma diminuição da produção de Aβ, tem um efeito benéfico em relação à perda sináptica e à neuroinflamação.

In flowering plants fertilization occurs when a pollen tube delivers the sperm cells to the female gametes within floral tissues. Therefore understanding of pollen tube development is fundamental for comprehension of plant reproduction. Pollen tube elongation involves many interactions, including cell-cell recognition and intracellular and intercellular signalling. These responses involve the activation of complex signalling networks and rapid synthesis and release of specific molecules. Phosphoinositides are emerging as novel second messengers in plant cells. In the classical pathway phosphatidylinositol monophosphate kinases (PIP kinases) transform phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns4P) to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PtdIns(4,5)P2], which has been implicated in vesicle trafficking and cytoskeletal rearrangements, crucial events in pollen tip growth. A reverse genetics approach was used to investigate the function of the Arabidopsis thaliana pollen-expressed gene encoding phosphatidylinositol-4- monophosphate 5-kinase 4 (PIP5K4). Pollen germination, tube growth, and polarity were significantly impaired in homozygous mutant plants lacking PIP5K4 transcript. In vitro, supplementation with PtdIns(4,5)P2 rescued these phenotypes. In vivo, pip5k4 null mutant allele was transmitted through the pollen at a reduced frequency and exhibited a competitive disadvantage when compared to wild-type pollen. Nevertheless pollen from pip5k4 mutant plants fertilized ovules leading to normal seed set and silique length. Analysis of endocytic events using FM1-43 (or FM4-64) suggested a reduction in endoexocytosis and membrane recycling in pip5k4 null mutant pollen tubes. Imaging of elongating tobacco (Nicotiana tabacum) pollen tubes transiently transformed with a PIP5K4-green fluorescent protein fusion construct revealed that the protein localized to the plasma membrane, particularly in the sub-apical region. Over-expression of PIP5K4-GFP delocalized the protein to the apical region of the plasma membrane, perturbed pollen tube growth, and caused apical cell wall thickening. Consequently PIP5K4 seams to play an important role in regulating the polarity of pollen tubes supporting a model for membrane secretion and recycling where the apical and sub-apical regions appear to contain the components required to promote and maintain growth.