Chronic heart failure (CHF) is a worldwide public health problem. It consists of a complex condition characterized by inadequate cardiac function, accompanied by cardinal symptoms and multiple signs and comorbidities. The pathophysiology of heart failure (HF) is not completely understood; however, it usually culminates in a progressive myocardial dysfunction associated with continuous ventricular remodelling. Nowadays, it is also well established that immune system activation promotes a systemic inflammatory status in this condition. HF patients, independent from prevalent systolic or diastolic dysfunction, present increased levels of several pro-inflammatory cytokines, associated with adverse clinical outcomes. Peripheral blood cells have been suggested as a potential source for the prolonged systemic production of cytokines in CHF. Numerous studies propose the participation of these cells in the pathogenesis of the disease itself, contributing to progressive cardiac remodelling. Cardiac resynchronization therapy (CRT) is a guideline-recommended treatment for patients with drug-refractory HF, reduced left ventricle ejection fraction (LVEF), and left bundle branch block (LBBB). This therapy has beneficial effects on symptoms and cardiac remodelling in responder patients, such as reverse cardiac remodelling (with the reduction of left ventricular volumes and increased LVEF), improvement of New York Heart Association (NYHA)-based functional status, symptoms, and quality of life, reduction of brain natriuretic peptide, improvement in the six-minute walk test, and reduction of mortality and hospitalization for HF. In addition, previous studies have shown a reduction in inflammatory mediators in HF patients treated with CRT. Nonetheless, the connection between reverse cardiac remodelling, and the potential antiinflammatory effect of CRT and peripheral immune cells remains far from fully understood. Therefore, the overall goals of the present research were to elucidate the role of peripheral immune cells in CHF, to investigate the effect of CRT on immune cell dynamics, and to study the possible contribution of those cells to reverse cardiac remodelling. The specific aims included: first, to quantify and functionally characterize circulating innate immune cells, like monocytes and dendritic cells (DC), and cells from adaptive immunity, like the different functional subsets of lymphocytes in patients with advanced HF; second, to study the impact of CRT on those cells by evaluating their frequency of and functional activity in HF patients before and 6 months after CRT; and third, to investigate possible differences between responders and non-responders to CRT. To this end, this research was divided into two phases. First, blood samples were collected from HF patients scheduled for CRT. Subsequently, cells were identified, quantified, and characterized by flow cytometry through direct immunofluorescence membrane and intracytoplasmic staining protocols. Their functional characterization was also evaluated by flow cytometry, but after in vitro stimulation. The quantification of mRNA expression was conducted by real-time polymerase chain reaction (PCR). Statistical analyses were performed to compare data between the control group and HF patients. The second phase comprised a reassessment of patients 6 months after CRT, in which the same variables were analysed. At this time, statistical comparisons were performed not only between the control group and patients, but also between baseline assessment and follow-up, and between responders and non-responders to CRT. Patients with HF presented a significantly lower frequency of plasmacytoid DC (pDC) at baseline and a higher proportion of monocytes and myeloid DC (mDC) producing proinflammatory cytokines than normal individuals. As for adaptive immunity cells, circulating Tc17 cells tended to be higher in patients than in the control group. On the contrary, the level of cells measuring immune tolerance and homeostasis, regulatory T (Treg) cells, was decreased in HF patients. These differences characterize the inflammatory state of HF and support the idea that peripheral immune cells are involved in this inflammatory process. After CRT, a paradigm shift occurred within monocyte subsets: the frequency of classical monocytes (cMo) decreased while that of intermediate monocytes (iMo) increased among responder patients. This group also presented higher non-classical monocytes (ncMo) values at follow-up compared to the non-responder group. These findings suggest the involvement of monocyte subsets in reverse cardiac remodelling and CRT response. In addition, all patients presented a reduction in CD86 expression in all monocyte and DC subpopulations, indicating a compromise in the induction of the adaptive immune response by monocytes and DC. Moreover, in non-responders, the increased frequency of pro-inflammatory cytokines-producing DC persisted after CRT. Regarding T cell subpopulations, the frequency of Tc17 cells decreased after therapy, reaching levels similar to those in the control group. This observation was mainly found among responder patients. Additionally, the expression of IL-17 mRNA was detected in a few responders at initial evaluation and only in one responder at follow-up. These findings showed that IL-17-producing T cells appear to be suppressed after CRT. On the other hand, the level of Treg cells was not restored after treatment, and the production of inflammatory cytokines by CD8+ T cells increased during follow-up. In conclusion, although some cell subpopulations remained pro-inflammatory after CRT, the findings observed in responders indicate that CRT can modulate the behaviour of immune cells, potentially contributing to reverse cardiac remodelling and improving cardiac function. These findings help elucidate the complex relationship between the immune system and cardiac therapy, suggesting that CRT may benefit patients with CHF by improving symptoms, reversing cardiac remodelling, and altering the behaviour of immune cells, thereby potentially reducing the inflammatory response in the heart.

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells (APCs) that belongs a diversify group of cells, being still the main cells that can presents the antigen and activate T lymphocytes by inducing different kinds of cytokine production, which can influence the development of different profiles of lymphocytes. The production of IL-12p70 leads to the Th1 profile differentiation, furthermore the IL-23 production can be important for the establishment and maintenance of Th17 profile. Thus, IL-12 and IL-23 play an important role in the induction or establishment of the adaptive immune response. The aim of the study was characterize the DC AP284 cell line by checking its surface markers, TLRs expression and capacity of response to different TLRs agonists. Besides of that, the production of IL-12p40, IL-12p70, IL-23 and the ability to induce Th1 or Th17 profile were evaluated. AP284 cells have expressed surface molecules compatible with DCs including class II MHC, CD11c and 33D1. After stimulation using different TLRs agonists these cells produced higher amounts of de IL-12p40 and IL-23, but no IL-12p70 production was observed. The IFN-γ addition was not able to induce IL-12p70 production, instead of that an inhibition of the IL-12p40 and IL-23 production were observed. The results have also shown that AP284 cell line is related with the Th17 profile because higher amounts of IL-12p40 and IL-23, but not IL-12p70 were observed, besides of that the results showed an increase in IL-17 levels produced by mice lymph node cells after immunization with Freund’s adjuvant and BCG. Thus, AP284 cells can be important to study the mechanisms of induction and regulation related with the production of IL-12p40 and IL-23 working as a possible tool to study the establishment and maintenance of Th17 cells profile. Moreover, AP284 cells have some similar characteristics among the other immortalized murine DCs, but the AP284 line produces a much higher amount of IL-12p40 than all described cells and is also differentiated among them by the production of IL-23.

Dendritic cells (DCs) are a heterogeneous group of cells and the major activators of naive T lymphocytes. During antigen presentation, different types of cytokines are produced and they will interfere with the immune response profile generated. IL-12p70 promotes the differentiation of Th1 phenotype and IL-23 p enhances the Th17 response. Given the major role of IL-12 and IL-23 on the stabilization of the acquired immune response, the production of these cytokines is highly controlled and it is an issue for several studies. The objective of this work was to characterize a new lineage of DC, described as AP284, based on their surface markers and evaluate the ability of these cells to produce IL-12p40, IL-12p70 and IL-23 after different stimulus in vitro. Additionally it will be evaluate their phagocytic capacity and their ability to induce a Th1 and Th17 response in vivo. The expression of the markers was analyzed by flow cytometry and the quantitation of IL-12 and IL23 was performed by ELISA after stimulation of cells AP284 in vitro with lipopolysaccharide (LPS) and Escherichia coli. AP284 cells express MHC class II, CD11c and 33D1 on its surface, which are characteristic markers of DCs. After stimulus with LPS or E.coli, AP284 cells produce large amounts of IL-12p40 and IL-23 but do not produce IL-12p70. The production of IL-12p70 was not detected even when IFN-γ is added to prime cultures, moreover, priming the cells with IFN-γ promoted inhibition of IL-12p40 and IL-23. Our data sugest that the AP284 is a DC17 lineage. Thus, AP284 can be an important tool to study the mechanisms of induction or regulation of IL-23 production and a possible tool to study generation and maintenance of a Th17 profile.

A tolerância oral (TO) é um mecanismo fisiológico de resposta não-inflamatória sistêmica a um imunógeno previamente ingerido e mediado por células reguladoras. Na tolerância oral bystander, as respostas a um segundo imunógeno são reguladas quando apresentado junto ao imunógeno cuja tolerância foi previamente estabelecida. Duas linhagens de camundongos com fenótipos extremos de susceptibilidade (TS) e resistência (TR) à TO foram desenvolvidas por seleção genética bidirecional. Os animais TS têm perfil regulador e, quando infectados com Leishmania amazonensis, desenvolvem lesão reduzida; enquanto os TR, por seu perfil inflamatório, têm lesão exacerbada. Camundongos TR submetidos à tolerância oral bystander, isso é, tolerizados com ovalbumina (2 mg de OVA), imunizados com OVA e, simultaneamente infectados, têm lesão reduzida. O objetivo deste trabalho foi avaliar a participação das células imunoregulatórias (linfócitos T regulatórios Tregs - e células dendríticas tolerogênicas) na redução da lesão em animais submetidos à tolerância oral e infectados com L. amazonensis. Camundongos TR submetidos à tolerância oral bystander têm aumento das células Tregs no sítio da infecção associado à redução da lesão. A transferência de Tregs provenientes de animais tolerizados (2 mg de OVA) para TR infectados e imunizados (com OVA), mimetiza o efeito da tolerância oral bystander, diminuindo a lesão inflamatória, sugerindo a participação de células Tregs na supressão bystander. Também foram transferidas células dendríticas (DCs) tolerogênicas, provenientes dos linfonodos mesentéricos de animais TR ou TS tolerizados, para camundongos TR infectados. Foram avaliados o desenvolvimento da lesão e a proporção de células Tregs (CD4+ CD25+ Foxp3+) nos animais infectados. O desenvolvimento da infecção foi menor nos camundongos TR que receberam DCs tolerogênicas (provenientes tanto de TR quanto de TS tolerizados), comparando aos somente infectados, sendo similar aos tolerizados e infectados (tolerância oral bystander), sugerindo a participação de células Tregs na supressão bystander. A transferência de DCs tolerogênicas também aumentou a proporção de Tregs nos TR infectados. Nossos resultados permitem inferir que as DCs tolerogênicas, possivelmente induzindo a diferenciação de Tregs, participam da diminuição da lesão inflamatória em animais infectados com L. amazonensis, sendo um dos mecanismos da tolerância oral bystander.

O condiloma acuminado é uma infecção causada pelo papiloma vírus humano (HPV) que se apresenta como a doença sexualmente transmissível de origem viral mais incidente, podendo ocorrer em qualquer fase da vida, sendo mais prevalente em jovens (ALMEIDA FILHO et al, 2005). É a patologia anal mais comum em pacientes infectados pelo vírus HIV. A incidência da doença varia de 15,7 a 62%, sendo maior em homossexuais masculinos (MANZIONE, 2003). O HPV de forma isolada não parece suficiente para a carcinogênese, e a progressão tumoral que ocorre em pequena porcentagem de indivíduos, pode ser estimulada por mutágenos químicos ou físicos (MANZIONE, 2004). Com o aumento da incidência do câncer anal em pacientes com aids, o HIV tem sido descrito como co-fator que o HPV necessita para induzir à NIA e ao carcinoma (MODESTO; GOTTESMAN, 1994). O HIV determinaria imunodepressão local, causando resposta imune inata deficiente à infecção viral, elevando as taxas de NIA e câncer na área genital e perianal (ARANY et al, 1998). A prevalência NIA induzida pelo HPV aumenta entre pacientes HIV positivos enquanto a contagem dos linfócitos T CD4+ diminui (VARNAI et al, 2006). Entretanto, a razão da transformação tumoral dessas lesões permanece incerta (NADAL, 2006). As céluas dendríticas (DC), como as de Langerhans, detectam antígenos na epiderme, se tornam ativadas e migram para as estações linfonodais, onde os apresenta aos linfócitos T, iniciando, desta forma, a resposta imune cutânea. Nadal e colaboradores descreveram a diminuição da freqüência das células dendríticas em pacientes HIV positivos com câncer anal sem relação com o prognóstico. A função dessas células infiltrando os carcinomas anais e atuando na resposta inflamatória ainda é pouco conhecida. A ativação destas células, em pacientes HIV positivos, parece ser inadequada por provável bloqueio desencadeado por fator tumoral, como o TGF-beta-1 produzido por tumores de pele e determina a imobilização das DC, impedindo sua migração para os linfonodos, reduzindo assim o número de células T que infiltrariam o tumor, evitando sua regressão (WEBER et al, 2005). Não se sabe se a ocorrência determina ou apenas acompanha a evolução para a NIA e o câncer (NADAL, 2006). Desta forma, o presente estudo buscará analisar a variação da densidade das células dendríticas (DC CD1a+ e DC DC-SIGN+) da mucosa anal de pacientes portadores de condiloma acuminado infectados pelo HIV, a relação com o estadiamento clínico do HIV, a associação com a NIA e fatores relacionados a recidivas do condiloma na mucosa anal e região perianal, na principal instituição pública de apoio a pacientes HIV positivos de Manaus-AM.

As bactérias do complexo Burkholderia cepacia (Bcc) são responsáveis por infeções respiratórias severas em indivíduos suscetíveis, em particular doentes com fibrose quística (FQ). Estas bactérias são especialmente temidas devido à sua elevada transmissibilidade, à sua inerente resistência à terapia antimicrobiana e ao risco de síndrome da cepacia. Tem sido descrito que Burkholderia cenocepacia, uma das bactérias mais virulentas do Bcc, possui mecanismos que lhe permite evadir a resposta imune do hospedeiro, através da modulação das funções de células fagocíticas. De entre estas, as células dendríticas (DCs) desempenham um papel essencial na defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos invasores, relacionando a resposta imune inata e adaptativa. Contudo, o seu papel no desenvolvimento da estratégia evasiva de B. cenocepacia ao sistema imune do hospedeiro, permanece pouco esclarecido. Para clarificar esta questão, neste trabalho foi estudada a interação das DCs com 4 variantes clonais de B. cenocepacia, isoladas de um mesmo doente com FQ. Concretamente, pretendeu-se verificar se existiam diferenças entre estas variantes ao nível de: internalização pelas DCs, capacidade de inibirem e/ou induzirem o processo de maturação das DCs, efeito na viabilidade das DCs e a consequência imunológica, em termos da ativação da resposta adaptativa. Demonstrou-se então que as variantes clonais consideradas mais virulentas, com base em dados anteriores, são as mais internalizadas pelas DCs. Todas as variantes, mas especialmente a última isolada imediatamente antes da morte do doente não induzem a maturação das DCs, processo que normalmente acontece nestas células em resposta a patogénios e que é essencial para ativar uma resposta adaptativa efetora. Foi também a última variante clonal isolada do doente que induziu mais morte celular (apoptose) nas DCs, reforçando a ideia de que é a variante mais virulenta. Apesar destes resultados, as DCs após internalização das várias bactérias, mas especialmente com a última variante, são capazes de estimular a expressão de IFN-γ em células T, sugerindo a indução de uma resposta adaptativa efetora. No entanto, este resultado não exclui a hipótese de que a modulação das funções das DCs pelos isolados de B. cenocepacia seja um importante contributo para restringir, pelo menos parte desta resposta, sendo necessário mais estudos para esclarecer este assunto.

O cancro é a segunda principal causa de morte na Europa, apenas superado pelas doenças cardiovasculares. Como tal, é essencial a investigação e desenvolvimento de novas e melhoradas terapias para combater esta doença. A imunoterapia tem sido, nas últimas duas décadas, uma abordagem terapêutica atractiva e potencialmente eficaz para combater o cancro. Nas últimas décadas, foram propostos diversos mecanismos para "instruir" células dendríticas (DCs) a induzir respostas imunes contra os antigénios tumorais, cessando assim a tolerância imunológica. Esta revisão vai abordar os princípios da resposta imune durante o desenvolvimento do cancro e sua correlação com a função das DCs, bem como, os princípios e limitações das vacinas para o cancro. Uma visão geral das várias metodologias utilizadas para modulação in vivo das DCs e ativação direta das células T in vivo será fornecida, com referência às suas vantagens, limitações e estratégias de optimização. Por fim, as perspectivas futuras sobre a aplicação destas vacinas em contexto clínico, com menção ao design dos ensaios clínicos e os resultados prognósticos da combinação da imunoterapia com outras modalidades terapêuticas, serão discutidos.

Macrophages and dendritic cells (DCs) play an essential role during mycobacterial infection, acting as key effector cells in bacterial killing and antigen presentation. Cathepsins are host proteases involved in pathogen destruction and antigen presentation. This makes these proteases, as well as both cell types, perfect targets for mycobacterial manipulation. In the first part of this thesis the role of mycobacteria during macrophage activation and DC maturation was addressed. By flow cytometry the surface expression of activation and maturation markers of mycobacteria infected human macrophages and DCs, was analyzed. It was demonstrated that: (1) M. tuberculosis H37Ra prevents the induction of the classical activated macrophage phenotype; (2) induces the maturation process of immature DCs; (3) the outcome of infection with M. tuberculosis H37Ra differs from that with M. smegmatis. These results indicate that M. tuberculosis infection has a differential role during macrophage activation and DC maturation and that M. tuberculosis H37Ra interferes with these processes differently of the non-pathogenic M. smegmatis. In the second part, we aimed to decipher the role of cathepsins during mycobateria infection of macrophages and DCs. Cathepsins protein levels were analyzed by western blot after infection with pathogenic or non-pathogenic mycobacteria. It was shown that cathepsin B and S levels during M. tuberculosis infection are distinct from those of host cells that internalized M. smegmatis and this is dependent on the host cell species tested. In addition, the role of these proteases in M. tuberculosis intracellular survival was evaluated by silencing cathepsins expression, using shRNA lentiviral vectors. It was observed, that cathepsin B and S knockdowns led to an increase in M. tuberculosis H37Ra intracellular survival. Altogether, these evidences point for a role of both cathepsins in the control of M. tuberculosis intracellular growth and demonstrate that M. tuberculosis modulates these cathepsins differently of the non-pathogenic M. smegmatis.

Objetivo: Apesar dos avanços alcançados nas terapêuticas atuais, o desenvolvimento de vacinas profiláticas, seguras e altamente imunogénicas para controlar e erradicar o vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser uma das tarefas mais exigentes e desafiantes. Para prevenir a infeção por HIV, as células apresentadoras de antigénio (APCs) altamente especializadas, têm de induzir respostas imunitárias humorais e celulares eficazes. Mais especificamente, a indução de anticorpos neutralizantes específicos contra o vírus (nomadamente as imunoglobulinas (Ig)G, IgA e IgE) secretados pelos linfócitos B, especialmente no local de entrada do vírus (resposta tipo Th2), e a estimulação de linfócitos T citotóxicos juntamente com uma resposta do tipo Th1 parecem ser cruciais para travar a disseminação deste vírus. Deste modo, a persistência da infeção por HIV parece estar intimamente associada à inadequada estimulação de uma resposta imunológica eficaz e específica capaz de destruir o vírus. Esta resposta é bastante complexa, não existindo uma correlação directa entre a infeção por este agente e eventuais mecanismos de proteção ou controlo da disseminação da doença. O HIV liga-se ao receptor CD4 via glicoproteína gp120 do invólucro viral, a qual sofre uma alteração conformacional, facilitando a sua ligação a um dos dois co-recetores de referência, CCR5 ou CXCR4. A interação da gp120 com o recetor CD4 e os co-recetores é vital para que o vírus se ligue à célula. Contudo, para finalizar o processo de infeção vírus-célula, a glicoproteína gp41 do invólucro viral terá posteriormente de interagir com um recetor de fusão na célula. Após a fusão, o conteúdo viral é libertado para o interior da célula com a subsequente transcrição do RNA viral em DNA, que será transportado até ao núcleo e integrado no genoma celular, sendo posteriormente traduzido em proteínas. Estas proteínas virais, juntamente com o RNA viral, são transportados para a superfície celular iniciando a formação de novos viriões maduros. Os linfócitos T e B, os macrófagos e as células dendríticas (DCs) podem expressar os co-recetores CCR5 ou CXCR4, estando portanto suscetíveis à infeção por HIV. No entanto, apenas as DCs podem ligar-se à glicoproteína gp120 sem que haja fusão membranar. As DCs são atualmente reconhecidas como entidades fundamentais para a estimulação de uma resposta imunológica robusta e específica contra o HIV, a qual se deve à sua capacidade de migração para os órgãos linfáticos, zonas ricas em linfócitos T, onde apresentarão os antigénios fagocitados e consequentemente levarão à estimulação dos linfócitos T CD4+ e CD8+, promovendo um eficiente e prolongado controlo da replicação do vírus no hospedeiro. No entanto, o papel destas APCs na imunologia do HIV está longe de ser um tema consensual. Estas células podem capturar, processar e apresentar o HIV desencadeando uma resposta eficaz e específica. Contudo, uma vez infetadas, as DCs podem infetar os linfócitos T, promovendo a disseminação do vírus e a progressão da doença. A fase crónica e assintomática da doença é caracterizada por um decréscimo da carga viral, persistindo o vírus latente em tecidos extravasculares, nódulos linfáticos, DCs e nos linfócitos T CD4+. Embora seja reconhecido o papel dos linfócitos T no controlo da infeção crónica por HIV-1, a imunidade especificamente induzida contra este microrganismo decresce após períodos prolongados da supressão do vírus, não conseguindo controlar a replicação do vírus e consequentemente originando a progressão da doença. Apesar destes doentes serem tratados com medicamentos antiretrovirais, reconhecidos como a melhor opção terapêutica atualmente disponível, estes tratamentos são dispendiosos, apresentam efeitos secundários significativos inerentes à sua toxicidade, dificultando a adesão à terapêutica por parte do doente por longos períodos. Mesmo na presença de medicamentos antiretrovirais, o vírus permanece latente no organismo em níveis não detetáveis, nomeadamente em linfócitos T CD4+ memória. Estes estão inativos, constituindo reservatórios que protegem o vírus da resposta imunológica e da terapêutica antiretroviral, tornando praticamente impossível a eliminação total do vírus com as abordagens terapêuticas actualmente disponíveis. O desenvolvimento de vacinas preventivas e de abordagens imunoterapêuticas contra a infeção por HIV tem sido bastante dificultado pela complexidade dos mecanismos imunológicos associados. De fato, a mutação do vírus, a capacidade deste ultrapassar a resposta imunológica humoral, bem como a manipulação das APCs evitando a maturação destas e portanto a eficaz apresentação dos antigénio aos linfócitos T, têm contribuído para a falta de eficácia obtida por inúmeros candidatos. Deste modo, torna-se desejável o desenvolvimento de novas estratégias capazes de modelar a resposta imunológica contra a infeção por HIV. As nanopartículas (NPs) poliméricas constituem sistemas promissores para o transporte de antigénios HIV-1. De fato, estes nanosistemas protegem os antigénios de HIV-1 das condições desfavoráveis após a sua administração e podem atuar como adjuvantes, aumentando o reconhecimento e a internalização de antigénios pelas DCs. Assim, este projeto único e inovador tem como objetivo criar uma vacina contra o HIV-1 através da encapsulação dos péptidos antigénicos inibidores de fusão do HIV-1, derivados da sequência da região helicoidal adjacente ao C-terminal da gp41, T20 e T1249 em NPs poliméricas. É importante referir que estes péptidos de HIV-1 nunca foram associados a partículas poliméricas. Materiais e Métodos: As NPs poliméricas foram preparadas utilizando o método de dupla emulsão com a evaporação do solvente. O álcool polivinílico, o co-polímero Pluronic® F127 e o glicol quitosano foram incluídos na formulação da vacina para promover o seu potencial efeito adjuvante e/ou aumentar a estabilidade das NPs. O antigénio modelo ovalbumina e os péptidos de HIV-1 gp41, T20 e T1249, foram incorporados ou co-incorporados nas NPs. A caracterização da NPs foi realizada tendo em conta o tamanho, a carga e morfologia da sua superfície por Dispersão Dinâmica de Luz, Dispersão Electroforética da Luz e Microscopia de Força Atómica, respetivamente. A eficiência de incorporação (EE, % (w/w)) e capacidade de carga (LC, μg/mg) dos agentes incorporados foram quantificados por MicroBCA®, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e fluorescência. As DCs foram usadas para avaliar a citotoxicidade in vitro das NPs através do ensaio AlamarBlue® e a captura e tráfego intracelular das NPs marcadas com rodamina foram estudados por microscopia confocal. A integridade da estrutura dos péptidos foi ainda confirmada por electroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes, utilizando o dodecil sulfato de sódio. Resultados: As NPs apresentaram diâmetros médios compreendidos entre 170-180 nm, com uma distribuição de tamanhos restrita (PdI < 0,15), carga superficial próxima da neutralidade e forma esférica. Estes sistemas de transporte de antigénios apresentaram elevados EE e LC, e nenhum efeito citotóxico em DCs, na gama de concentrações testadas (0,125-1 mg/mL), após 24, 48 e 72 h de incubação. Tendo em consideração os resultados previamente descritos, nomeadamente as características físico-químicas das NPs, a formulação PLGA-PEG_GCs foi selecionada para os restantes estudos. A estrutura dos péptidos foi mantida intacta, não sendo afetada pelo processo de dupla emulsão. A microscopia confocal confirmou a internalização das NPs, demonstrando a sua localização endosomal e uma tendência para se acumularem perto do retículo endoplasmático. Conclusões: Os resultados aqui descritos mostram que NPs estáveis e reprodutíveis foram produzidas utilizando um método de dupla emulsão com evaporação de solvente modificado. Importa no entanto realçar que as NPs PLGA- PEG_GCs constituem uma plataforma promissora para o transporte e eficaz apresentação de antigénios de HIV, tendo em vista o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra a infeção por HIV-1.